Для начала возьмите пробирку с hBM-MSC и гранулируйте их центрифугированием. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в соответствующем объеме базальной среды. Затем приготовьте конические центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров, содержащие необходимый объем базальной среды с добавлением соответствующих факторов роста.
Наконец, добавьте hBM-MSCs из исходного раствора в разведении от одного до 66,67 для достижения концентрации 1,5 умножить на 10 к пятым клеткам на миллилитр. Снимите полипропиленовую клеевую пленку, закрывающую 96-луночную гидрогелевую пластину, чтобы засеять пластину. Осторожно отсадите буфер для хранения, покрывающий гидрогели, расположив наконечник аспиратора у стенки лунки и медленно двигаясь к краю внутренней лунки.
Во время посева периодически перемешивайте клеточную суспензию, чтобы смесь оставалась однородной, и добавляйте по 200 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку пластины. Затем поддерживайте в культурах температуру 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в увлажненной атмосфере. В качестве альтернативы используйте автоматическую промывку пластин с аспирационными форсунками, установленными на расстоянии не менее 3,8 миллиметра от держателя пластин и ближе к краю лунки, и аспирируйте буфер для хранения.
Засейте планшет, смешав клетки с помощью серологической пипетки и распределив равное количество клеток в лунку планшета. Наблюдайте за развитием культур с помощью светлопольной микроскопии с пятикратным объективом и получайте эталонные изображения примерно через 30 минут после посева, чтобы оценить количество добавленных клеток.
Krattiger, L. A., Mitsi, M., Simona, B. R., Ehrbar, M. Establishing the 3D Stromal Monoculture. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e200256, doi:10.3791/200256 (2023).