416 Views
•
03:44 min
•
May 19, 2023
DOI:
Для начала возьмите совместное культивирование hBM-MSCs и GFP-HUVECs и промойте один раз 200 микролитрами PBS. Добавьте субстрат BCIP/NBT и инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия, периодически контролируя развитие цвета. Как только цвет разовьется в неостеогенных условиях, сразу же промывают 200 микролитрами на лунку PBS.
После фиксации образцов в 4%-ном параформальдегиде приобретаются цветные изображения окрашенных образцов. Чтобы количественно оценить активность ЩФ в клеточных лизатах, добавьте 200 микролитров на лунку 0,25% трипсина-ЭДТА в культуры, промытые PBS, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия. Перемешивайте культуры каждые 10 минут, энергично пипетируя вверх и вниз, чтобы облегчить пищеварение, и контролируйте морфологию культуры с помощью стандартного микроскопа для клеточных культур.
Затем переложите образцы в 2-миллилитровые пробирки и добавьте 200 микролитров базальной среды мезенхимальных стволовых клеток для ингибирования трипсина. После центрирования и удаления надосадочной жидкости заморозьте гранулы при температуре 80 градусов Цельсия или приступайте непосредственно к следующему этапу. Разморозьте клеточные гранулы, добавьте 500 микролитров буфера для лизиса и инкубируйте в течение 30 минут на льду.
Затем центрифугируйте при 16, 100 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и держите образцы на льду. Не повреждая гранулированный мусор, дозируйте по 50 микролитров надосадочной жидкости в каждую лунку 96-луночного планшета для прозрачной культуры тканей в двух экземплярах. Добавьте 50 микролитров приготовленного реагента щелочной фосфатазы в лунки 96-луночного планшета для культуры тканей.
Коротко встряхните тарелку и выдержите ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут в защищенном от света месте. Остановите реакцию, добавив 100 микролитров 1-молярного гидроксида натрия с помощью многоканальной пипетки. С помощью считывателя пластин считайте оптическую плотность на 410 нанометрах.
Для количественного определения ДНК разморозьте замороженные образцы, центрифугируйте их и поместите на лед. Не повреждая гранулированный мусор, нанесите 50 микролитров надосадочной жидкости клеточного лизата в лунки черного 96-луночного планшета в двух экземплярах. Добавьте стандарты ДНК в дубликатах.
Затем с помощью многоканальной пипетки добавьте 50 микролитров красителя ДНК, затем инкубируйте и считайте интенсивность флуоресценции в соответствии с инструкциями производителя. Используйте стандартные значения кривой для определения и применения преобразования измеренных значений интенсивности в концентрации ДНК. Наконец, нормализуйте значения щелочной фосфатазы, разделив их на соответствующую концентрацию ДНК в каждом образце.
Количественное определение активности щелочной фосфатазы для характеристики остеогенного потенциала культур показало, что нормализованная активность щелочной фосфатазы сильно варьировала в зависимости от условий с тенденцией к увеличению активности при более высоких концентрациях BMP-2 и плато на уровне 100 нанограммов на миллилитр. Самые низкие уровни активности были выявлены для состояния, содержащего 50 нанограммов на миллилитр FGF-2. Более обширное и интенсивное окрашивание пурпурным цветом наблюдалось в присутствии БМП-2 по сравнению с FGF-2.
01:15
Простое создание васкуляризированной остеогенной ниши костного мозга с использованием предварительно изготовленных гидрогелей из полиэтиленгликоля (ПЭГ) в микропланшете для визуализации
Видео по теме
1134 Views
01:46
Создание монокультуры 3D стромы
Видео по теме
281 Views
01:48
Создание 3D-культуры стромально-эндотелиальных клеток
Видео по теме
469 Views
02:34
Количественная оценка формирования сети эндотелиальных клеток после 3D кокультуры стромально-эндотелиальных клеток
Видео по теме
323 Views
03:44
Оценка остеогенной дифференцировки 3D стромально-эндотелиальных клеток путем мониторинга активности щелочной фосфатазы
Видео по теме
415 Views
03:44
Assessing the Osteogenic Differentiation of 3D Stromal-Endothelial Cells by Monitoring the Alkaline Phosphatase Activity
Видео по теме
415 Views
01:15
3D Co-Culture Assay: Vascularized Osteogenic Niches for Cancer Drug Screening
Видео по теме
1.1K Views
04:59
Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm
Видео по теме
15.3K Views
01:48
Establishing the 3D Stromal-Endothelial Cell Co-Culture
Видео по теме
469 Views
02:34
Quantifying the Endothelial Cell Network Formation After the 3D Stromal-Endothelial Cell Co-Culture
Видео по теме
323 Views
Read Article
Цитировать это СТАТЬЯ
Krattiger, L. A., Mitsi, M., Simona, B. R., Ehrbar, M. Assessing the Osteogenic Differentiation of 3D Stromal-Endothelial Cells by Monitoring the Alkaline Phosphatase Activity. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e200259, doi:10.3791/200259 (2023).
Copy