Диссекция и обработка хрусталика мыши для изучения сложных межклеточных интердигитаторов и мембранной архитектуры

Начните с позиционирования усыпленной мыши для энуклеации глаза с помощью изогнутых щипцов, чтобы прижать ткань вокруг глаза, чтобы вытеснить глаз из глазницы. Затем поднимите и удалите глаз, а затем перенесите его в свежий PBS в лоток для вскрытия. С помощью ультратонких ножниц разрежьте зрительный нерв как можно ближе к глазному яблоку и осторожно введите тонкий кончик прямым пинцетом в глазное яблоко через выход зрительного нерва в задней части глаза.

Теперь вставьте ножницы в заднюю часть глаза и начните делать разрез от заднего к склеральному соединению роговицы и продолжайте разрез до тех пор, пока не будет отделена половина соединения. Аккуратно надавите на роговицу, чтобы хрусталик мог выйти через разрез. С помощью тонкого кончика прямого пинцета аккуратно удалите любые крупные кусочки ткани с линзы.

Найдя экваториальную область, неглубоко прокалывают линзу, а затем снимают капсулу хрусталика. Перенесите клетки волокна хрусталика в 60-миллиметровую чашку с 1% параформальдегида. С помощью острого скальпеля расщепите шарик клеток волокна пополам по его передней задней оси.

А затем далее разрезаем половинки по той же оси, чтобы получились четвертинки. С помощью прямого пинцета удалите область ядра из клеточной четверти волокна хрусталика. Далее добавьте 200 микролитров 1%-ного параформальдегида в 48-луночный планшет.

Перенесите кору хрусталика в пластину и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре с легким встряхиванием при 300 об/мин. После блокирования добавьте соответствующие первичные антитела в 48-луночный планшет и перенесите образцы в раствор первичного антитела. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия с легким встряхиванием или мутацией.

На следующий день промойте образцы с помощью PTX, и аналогично инкубируйте их со вторичными антителами. После промывки образцов добавьте одну каплю или 50 микролитров монтажного материала на предметное стекло микроскопа с плюсовым зарядом. Поместите салфетку в монтажный материал.

И с помощью пинцета аккуратно отделите клетки волокна друг от друга. Затем аккуратно поместите защитный лист поверх отделенных ячеек и монтажного материала. После удаления излишков среды используйте лак для ногтей, чтобы запечатать края покровного стекла на предметном стекле перед конфокальной микроскопией.

После вскрытия хрусталика и удаления капсулы хрусталика перенесите клеточную массу волокна на кончики пальцев во влажных перчатках и аккуратно прокатите во всех направлениях, чтобы отделить ядро хрусталика. Затем перенесите ядро хрусталика в свежеприготовленный 1% раствор параформальдегида в 48-луночный планшет и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия с легким встряхиванием или мутацией. На следующий день перенесите образец в 60-миллиметровую чашку с 1% параформальдегида и с помощью острого скальпеля расщепите ядро хрусталика по передней задней оси пополам, а затем на четверти.

Затем постфиксируют, блокируют, окрашивают и монтируют образец, как было показано ранее В этих препаратах из разных областей хрусталика обнаруживаются пучки клеток хрусталика с уникальной морфологией. Окрашивание F-актиновой сети показывает обогащение клеточной мембраны дифференцированными и зрелыми волокнами, в то время как сигналы F-актина присутствуют в цитоплазме ядерных волокон. Сканирующая электронная микроскопия и конфокальные изображения дифференцирующих клеток волокон показывают межпальцевые шарики и впадины с небольшими блокирующимися выступами, в то время как зрелые волокна имеют лопасти, украшенные небольшими выступами.

Сканирующая электронная микроскопия и конфокальная микроскопическая визуализация клеток волокон ядерного хрусталика выявляют редкие и более крупные взаимосвязанные выступы на коротких сторонах клеток, где клеточная мембрана шероховатая и имеет язычковые и бороздчатые межпальцевые соединения в этих клетках от центра хрусталика.