Журнал
/
/
/
Приготовление добавки трансляционного экстракта Leishmania из клеточного концентрата
JoVE Journal
Биоинженерия
Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove  Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
JoVE Journal Биоинженерия
Preparation of Supplemented Leishmania Translational Extract from Cell Concentrate

Приготовление добавки трансляционного экстракта Leishmania из клеточного концентрата

English

Сгенерировано автоматически

299 Views

02:34 min

November 08, 2024

DOI:

02:34 min
November 08, 2024

35 Views
, ,

ТРАНСКРИПТ

Automatically generated

Для начала соберите урожай с ночных культур Leishmania tarentolae. Измерьте оптическую плотность урожая культур на длине 600 нанометров, используя разведение в культуральной среде в соотношении 1:10. Рассчитайте целевой объем концентрата для достижения конечной оптической плотности 300 при 600 нанометрах.

Переложите собранную клеточную культуру в подходящие центрифужные флаконы. Центрифугируйте флаконы при температуре 2 500 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем осторожно сцеживают надосадочную жидкость в емкость для отходов культивирования.

Промойте гранулу ячейки в 500, 200 и 20 миллилитрах буфера SEB. Затем перелейте ресуспендированный концентрат SEB в подходящий промытый объемный цилиндр. Доведите объем до целевого объема с помощью холодного SEB, а затем аккуратно перемешайте с помощью пипетки.

Чтобы лизировать клеточный концентрат, перенесите его в предварительно охлажденное азотное кавитационное устройство. Нагнетайте давление до 70 бар и выдерживайте в течение 45 минут на льду. Далее откройте вентиляционное отверстие на кавитационном устройстве и вытолкните лизат в очищенную колбу вакуумного ресивера, помещенную на лед.

Затем переложите лизат в центрифужные пробирки и центрифугируйте при 10 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. После переноса надосадочной жидкости в свежие пробирки центрифугируйте лизат при 30 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Затем переложите надосадочную жидкость в свежую центрифужную пробирку, помещенную на лед.

Установите четыре колонки для фильтрации геля PD-10 с гравитационной подачей на 10 миллилитров лизата в формате штатива, который позволяет капать их в подходящий лоток для сбора. Добавьте по 2,5 миллилитра лизата в каждую колонку. Как только он перейдет в колонку, добавьте 0,5 миллилитра элюирующего буфера, чтобы отстояться лизат.

Снимите лоток для мусора и поместите лоток для свежего сбора под колонны. Затем добавьте 2,5 миллилитра элюирующего буфера, чтобы элюировать отфильтрованный гель лизат. Соберите отфильтрованный гелем лизат в свежую центрифужную пробирку.

Затем измерьте поглощение отфильтрованного лизата на расстоянии 280 нанометров с помощью спектрофотометра NanoDrop. Добавьте пятикратный питательный раствор в лизат в соотношении 2:5. Затем тщательно перемешайте смесь.

Разложите смесь по 1,5 миллилитровым микроцентрифужным пробиркам, а затем заморозьте пробирки в жидком азоте для дальнейшего использования.

Read Article