Для начала соберите урожай с ночных культур Leishmania tarentolae. Измерьте оптическую плотность урожая культур на длине 600 нанометров, используя разведение в культуральной среде в соотношении 1:10. Рассчитайте целевой объем концентрата для достижения конечной оптической плотности 300 при 600 нанометрах.
Переложите собранную клеточную культуру в подходящие центрифужные флаконы. Центрифугируйте флаконы при температуре 2 500 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем осторожно сцеживают надосадочную жидкость в емкость для отходов культивирования.
Промойте гранулу ячейки в 500, 200 и 20 миллилитрах буфера SEB. Затем перелейте ресуспендированный концентрат SEB в подходящий промытый объемный цилиндр. Доведите объем до целевого объема с помощью холодного SEB, а затем аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
Чтобы лизировать клеточный концентрат, перенесите его в предварительно охлажденное азотное кавитационное устройство. Нагнетайте давление до 70 бар и выдерживайте в течение 45 минут на льду. Далее откройте вентиляционное отверстие на кавитационном устройстве и вытолкните лизат в очищенную колбу вакуумного ресивера, помещенную на лед.
Затем переложите лизат в центрифужные пробирки и центрифугируйте при 10 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. После переноса надосадочной жидкости в свежие пробирки центрифугируйте лизат при 30 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Затем переложите надосадочную жидкость в свежую центрифужную пробирку, помещенную на лед.
Установите четыре колонки для фильтрации геля PD-10 с гравитационной подачей на 10 миллилитров лизата в формате штатива, который позволяет капать их в подходящий лоток для сбора. Добавьте по 2,5 миллилитра лизата в каждую колонку. Как только он перейдет в колонку, добавьте 0,5 миллилитра элюирующего буфера, чтобы отстояться лизат.
Снимите лоток для мусора и поместите лоток для свежего сбора под колонны. Затем добавьте 2,5 миллилитра элюирующего буфера, чтобы элюировать отфильтрованный гель лизат. Соберите отфильтрованный гелем лизат в свежую центрифужную пробирку.
Затем измерьте поглощение отфильтрованного лизата на расстоянии 280 нанометров с помощью спектрофотометра NanoDrop. Добавьте пятикратный питательный раствор в лизат в соотношении 2:5. Затем тщательно перемешайте смесь.
Разложите смесь по 1,5 миллилитровым микроцентрифужным пробиркам, а затем заморозьте пробирки в жидком азоте для дальнейшего использования.