Органотипическая 3D-культура кожи: метод культивирования in vitro на основе кассеты для регенерации эпидермиса человека на бесклеточной дерме

- Органотипические культуры кожи помогают получить реконструированную ткань кожи с типичными характеристиками эпидермальной дифференцировки и стратификации. Они имитируют функциональную и физиологическую архитектуру тканей in vivo.

Чтобы создать органотипическую кожу, сначала соберите предварительно вырезанную, мертвую, деэпидермизированную дерму на индивидуальную кассету верхним слоем вверх. Эта дерма образует субстрат для регенерации кожи.

Переверните кассетный узел, чтобы обнажить нижний слой дермы. Пипетировать искусственный внеклеточный матрикс поверх нижнего слоя. Дайте матрице затвердеть и обеспечьте структурную поддержку дерме.

Переверните сборку обратно в исходное положение. Добавьте нужный объем питательной среды кератиноцитов, чтобы погрузить в нее только нижний слой дермы. Добавьте суспензию кератиноцитов на верхний слой дермы, чтобы имитировать типичную архитектуру кожных тканей и инкубировать.

Во время культивирования питательная среда, диффундирующая через дерму, способствует пролиферации кератиноцитов. Кроме того, расположение этих пролиферирующих кератиноцитов на границе раздела воздух-жидкость способствует их дифференцировке. Этот процесс регенерирует полностью стратифицированный эпидермис над девитализированным дермальным слоем, производя органотипическую реконструкцию кожи. В следующем протоколе мы показываем создание органотипической кожи человека с использованием генетически модифицированных первичных кератиноцитов человека и девитализированной дермы человека.

- Чтобы сделать органотипические кассеты, с помощью прижигания удалите квадрат размером 1 сантиметр на 1 сантиметр от центра крышки чашки для культуры тканей размером 3,5 сантиметра. Прикрепите квадратные колышки к дну кассеты с помощью прозрачного лака для ногтей и дайте 5 минут, чтобы лак высох.

Наконец, переверните кассету и поместите кассету в 6-сантиметровую тарелку, положив кассету на колышки. Извлеките дерму из хранилища при температуре 4 градуса Цельсия и переложите ее в контейнер со средой для роста кератиноцитов для мытья.

После повторения мытья поместите дерму в свежий КГМ и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 2 дней. После инкубации с помощью скальпеля разрежьте дерму на кусочки размером 1,5 сантиметра на 1,5 сантиметра. Затем поместите его на квадратное отверстие органотипической кассеты верхней частью дермы вверх.

С помощью щипцов переверните всю органотипическую кассету, содержащую дерму. Добавьте пять капель свежеразмороженного внеклеточного матрикса на дно дермы и слегка встряхните, чтобы обеспечить равномерное распределение по дерме. Дав внеклеточному матриксу застыть в течение 5 минут, с помощью щипцов переверните кассету обратно, а затем добавьте 4 миллилитра КГМ в 6-сантиметровую чашку.

Затем, после сбора и подсчета генетически модифицированных кератиноцитов, ресуспендируйте от 0,5 до 1 миллиона клеток в 90 микролитрах КГМ и распределите клетки на дерму. Инкубируйте сокультуру при температуре 37 градусов Цельсия.

Меняйте СМИ о культурах через день. Полная стратификация и дифференцировка эпидермиса обычно происходит после 5 суток. Ткань можно заготавливать в течение 14 дней после нанесения покрытия.