Взрослые и эмбриональные скелетных мышц Microexplant культуры и выделение скелетных мышц стволовых клеток

Общая цель этой процедуры заключается в выделении обогащенных популяций стволовых клеток скелетных мышц из микродиссектированных тканевых имплантатов, полученных из взрослых мышц или эмбрионов, с целью изучения их поведения и функции. Эти клетки также могут иметь терапевтическое применение. Это достигается путем предварительного рассечения целевых мышц из туш взрослых мышей или эмбрионов из тканей матки в асептических условиях.

Вторым этапом процедуры является промывка и очистка мышечных тканей для взрослых мышечных тканей, рассечение жировых и соединительных тканей и перенос в свежую среду DF 20 для эмбрионов. Удалите наружные оболочки и внутренние органы и переложите в свежий DF 20. Средний, затем рассекайте, чтобы изолировать богатые мышцами области.

Третьим этапом процедуры является микродиссекция изолированных тканей в кубики размером 400 микрометров. Перенесите план поодиночке в центр 60 лунок по 96 лунок планшета и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия. Заключительным этапом процедуры является оценка клеток.

Клетки начнут появляться из успешных эксплантов от нескольких часов до двух недель, в зависимости от происхождения ткани. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие, что клетки, начинающие появляться из успешных клеток X-explan, могут быть расширены и впоследствии использованы для ряда различных целей in vitro и in vivo, включая пролиферацию и апоптоз, исследования и идентификацию белковых маркеров. Эти клетки также могут быть клонально получены, генетически модифицированы и, в конечном итоге, трансплантированы в хозяина для изучения регенерации или для тестирования терапевтических применений.

Здравствуйте, я Джанет Смит из моей лаборатории биологии стволовых клеток скелетных мышц Школы биологических наук Бирмингемского университета. Я Дин Лана из лаборатории Джанет Смит И я Байрон Чен, тоже из лаборатории Джанет Смит. Сегодня мы покажем вам процедуру получения культур стволовых клеток скелетных мышц из жиров Microdisect X, полученных из взрослых мышц и эмбрионов.

Мы используем эту процедуру в лаборатории для изучения поведения стволовых клеток скелетных мышц, такого как пролиферация, апоптоз и дифференцировка, а также для изучения функции аберантных мышечных стволовых клеток при таких заболеваниях, как мышечная дистрофия. Итак, приступим. Основной метод получения микроэксплантных культур из скелетных мышц начинается с вскрытия целевых мышц у только что замерзшей мыши в асептических условиях.

В этой демонстрации мышцы задних конечностей препарируются, изолированные мышцы промываются двумя сменами среды DF 20, а затем помещаются в свежую среду DF 20 в 60-миллиметровой посуде. С помощью стереодиссекционного микроскопа тщательно проводят микродиссекцию мышц в стерильных условиях, чтобы исключить жир, соединительную ткань и кости. Далее нарежьте очищенные мышечные кусочки кубиками кубиками по 400 микрометров с помощью ювелирных щипцов.

Поместите кусочки мышц по отдельности в центр 60 лунок из 96 луночной пластины, содержащей 50 микролитров DF 20 на пер. Хорошо заполните альтовые лунки солевым раствором, чтобы предотвратить пересыхание лунок, содержащих эксплан. Проверьте лунки под микроскопом, а затем поместите 96-луночную пластину в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия.

Прикрепление и вырастание микроэксплана оцениваются через 24–48 часов инкубации, а затем с интервалом от 48 до 72 часов в зависимости от скорости роста культивируемых мышц. Здесь показаны примеры выроста второго дня из бывших эксплантированных взрослых скелетных мышц и установленного выроста из экспланта с агрегированными культурами и высокой плотностью клеток. X explant был оценен в соответствии с уровнем слияния клеток в каждой отдельной лунке, что будет продемонстрировано позже для расширения и изоляции клеток SMS.

Культуру роста следует индивидуально контролировать для клеток с преобладанием морфологии SMS клеток, т.е. сферических одноядерных клеток с высокой рефракционностью, которые растут в агрегационных кластерах. Начните эту процедуру с рассечения эмбрионов Е 12,5 из матки. Эмбрионы стадии от Е 11.5 до Е 17.5 также могут быть препарированы таким образом.

Поместите эмбрионы по отдельности в чашки Петри, содержащие PECM, чтобы они были готовы к детальной микродиссекции. Затем отдельные эмбрионы дополнительно препарируются, чтобы изолировать участки, богатые скелетными мышцами. Сначала удаляют внутренние органы, рассекают хвост, заднюю часть и отпадают конечности, а также верхнюю и нижнюю стенки туловища.

Поместите все рассеченные ткани в свежий PECM, чтобы получить эмбрион. Микроэксплан-культуры микродискируют рассеченные четыре конечности, задние конечности и верхнюю и нижнюю стенки тела для получения небольших кубиков тканей одинакового размера. Поместите эти микрорастения по отдельности в центр 60 лунок из 96 луночного планшета, содержащего 50 микролитров PECM на лунку.

Для культивирования эмбрионов должно быть установлено не менее 60 лунок, содержащих одно растение в каждой лунке. Центр 60 скважин можно подразделить на области, указывающие на то, откуда был выведен эксплан. Эта конструкция позволяет иметь 15 лунок в каждой, каждая из которых содержит соответственно конечность, верхнюю стенку тела, заднюю конечность и нижнюю стенку тела.

Эксплан инкубируют при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех недель. В течение трехнедельной инкубации эксплан оценивают на третий, седьмой, 14-й и 21-й день культивирования с помощью инвертированного микроскопа. Эксплан оцениваются в соответствии с уровнем слияния клеток у каждого индивидуума. Колодец.

Этот пример иллюстрирует различные уровни слияния E 15.5 первичных эмбриональных экспланирующих культур, окрашенных мифом 5, от нуля до 14%15 до 24%25 до 49%50 до 74%и от 75 до 100%Фотографические изображения культур также могут быть получены после того, как COFLUENT X explan культуры, демонстрирующие морфологические особенности клеток SMS, могут быть субкультурами. Удалите питательную среду из выбранных лунок и отфильтруйте ее с помощью диска ACR 0,2 мкм. R шприцевого фильтра.

Сохраняют среду для использования кондиционированной среды к каждому. Ну и добавьте 100 микролитров дисков, разведенных один к 10 в PECM. Затем верните тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 20 минут.

Через 20 минут с помощью наконечника пипетки аккуратно соскребите ослабленные клетки с поверхности лунки, а затем центрифугируйте клеточную суспензию со скоростью, в 1000 раз превышающей силу тяжести, в течение трех минут, чтобы гранулировать клетки. Клетки разбавляют ресуссией, суспензируя их в двух миллилитрах ПЭСМ и затем переносят в лунки свежей 48-луночной пластины. Наконец, переложите смесь ячеек на 48 луночных планшетов для дальнейшего расширения.

Для подготовки клеток к анализу планшета отображают субкультуру, первичные эмбриональные культуры Splunk в PECM и кондиционированную среду на покровных листах в 48. Хорошо планшеты с клетками помещаются с плотностью три раза по 10 к трем клеткам квадратного сантиметра инкубатора 37 градусов Цельсия, чтобы позволить клеткам прикрепиться, что обычно занимает от четырех до шести часов для оценки апоптоза и пролиферации. Промойте ячейки на покровных стеклах дважды в PBS и зафиксируйте в 4% параформальдегиде на 20 минут комнатной температуры, после фиксации промойте чехлы в течение 10 минут PBS, затем заморочьте 10 мкг на миллилитр DPI в течение трех минут.

Оберните тарелку пленкой для мытья посуды один раз в PBS на пять-10 минут. После этого снимите крышку с лунки и переверните ее на пятно daco cyto nation. Монтажный материал на стеклянном предметном стекле уплотнить края крышки слипом с лаком для хранения.

Заверните горки в фольгу и поставьте при температуре минус 20 градусов Цельсия для подсчета. Слайды просматриваются под флуоресценцией на вертикальном микроскопе и оцениваются для апоптотических и митотических клеток с использованием IP grae. Когда explan аккуратно имплантируют из взрослых скелетных мышц или из эмбрионов, они начнут генерировать клетки в течение от нескольких часов до 72 часов инкубации при 37 градусах Цельсия.

В зависимости от их источника, расширение клеточной популяции будет происходить в течение нескольких дней для эмбриональных имплантатов или недель для более старых скелетных мышечных имплантатов для получения первичных культур агрегирующих СМС-клеток высокой плотности. Одна клетка, выделенная в 96-луночный планшет, становится колонией одноклеточного происхождения, что в конечном итоге приводит к созданию клональной популяции. Впоследствии для подтверждения идентичности клеток SMS используется иммуногистохимия MIF five.

Взрослые стволовые клетки, полученные из скелетных мышц, трансплантируются в переднюю большеберцовую мышцу мышей-хозяев, и эти клетки идентифицируются по мечению бета-ГК на этом изображении, сделанном через три месяца после инъекции, три недавно слившиеся бета-галактоположительные клетки, окрашенные в синий цвет, наблюдаются в мышечном волокне через 14 месяцев после инъекции, а обширный вклад btic галактоположительных клеток в мышечные волокна обнаруживается анти-бета-галакто-антителами, окрашенными в коричневый цвет. Бета-галактоположительная сателлитная ячейка обозначена стрелкой на этом изображении. Окрашивание отсутствует в контрольной группе, в которой не использовалось первичное антитело при выделении из введенных мышц хозяина через 12 месяцев после инъекции.

Кариотипирование бета-галактопозитивных клеток, пролиферирующих в культуре, линии клональных СМС-клеток мыши, выявляет нормальную диплоидную хромосомную комплемент бета-галакто экспрессию бета-галакто в колонии PD пять нулевых А-клеток показано гистохимическим анализом in vitro дистрофического эмбрионального мифа пять положительных миобластов показывают, что эти миобласты гиперпролиферативны и склонны к апоптозу, как показано на этом графике, скорость роста эмбриональных миобластов из культуры Muscle X explan увеличена как у MDX, так и у трех нокаутных мутантов CAV по сравнению с диким типом X. Здесь приведен пример эксплана MIF с пятью иммуноокрашенными свойствами. Гиперпролиферация эмбриональных миобластов наблюдается у этих MDX и CAV трех нокаутных мутантов, что определяется положительной иммунореактивностью KI 67.

Кроме того, у обоих этих мутантов наблюдается повышенный апоптоз, как показано окрашиванием DPI, и на этом изображении показан пример апоптотической клетки, обозначенный стрелкой. Мы только что показали вам, как изолировать стволовые клетки скелетных мышц от взрослых особей и провести микродиссекцию эмбриона. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости соблюдать осторожность с размером микрорассеченных эксплантов.

Если они будут слишком большими, они будут кричать, и клетки умрут. Если они слишком маленькие, они не будут поддерживать. Хороший рост продаж.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.