TALEN-опосредованная интеграция целевых генов: использование сконструированных последовательно-специфичных нуклеаз для точной вставки гена флуоресцентного белка в гиПСК

Начните с индуцированной человеком плюрипотентной стволовой клетки или суспензии ИПСК в среде. Добавьте пару активатороподобных эффекторных нуклеаз транскрипции или плазмид, кодирующих TALEN. Дополните донорской плазмидой, несущей ген флуоресцентного белка, соединенный с геном устойчивости к антибиотикам, с соседними гомологическими плечами для специфического выравнивания по локусам-мишеням.

Электропорируйте смесь для образования переходных пор в клеточных мембранах, что обеспечивает интернализацию плазмид. Попадая внутрь клеток, плазмиды, кодирующие TALEN, обрабатываются, производя TALEN - химерные белки, состоящие из сайт-специфичного ДНК-связывающего домена TALE, слитого с неспецифическим доменом расщепления эндонуклеазы рестрикции FokI.

Каждый мономер TALEN через свой ДНК-связывающий домен, состоящий из тандемных модулей повторов аминокислот, распознает и связывается с локусами-мишенями, по одному модулю на нуклеотид, на каждой цепи ДНК в противоположных ориентациях, разделенных спейсерной последовательностью. Затем домены FokI димеризуются и расщепляют ДНК в последовательности спейсера, создавая двухцепочечные разрывы с выступами.

В присутствии донорской плазмиды, содержащей гомологические плечи, комплементарные областям, фланкирующим расщепленный сайт, происходит гомологическая репарация с использованием гомологичной последовательности в качестве матрицы для синтеза репарации ДНК для моста двухцепочечных разрывов. После лигирования зазубрин промежуточный флуоресцентный белок и гены устойчивости к антибиотикам интегрируются в геном хозяина.

Обрабатывайте ИПСК с посевом на слое питающих клеток для поддержки роста с помощью антибиотических сред. Ген устойчивости к антибиотикам без промотора, приводимый в действие вышестоящим эндогенным промотором, облегчает отбор клеток, отредактированных TALEN.