Tol2 транспозон-опосредованный трансгенез данио-рерио: процедура получения трансгенных данио-рерио после совместной инъекции системы Tol2 в оплодотворенные эмбрионы данио-рерио

Начните с жизнеспособных эмбрионов данио-рерио на стадии одной клетки, помещенных в лунки формы для микроинъекций.

Загрузите в иглу для микроинъекций раствор, содержащий мРНК Tol2-транспозазу, кодирующую и донорские плазмиды транспозона. Плазмиды включают в себя вездесущий промотор данио-рерио и флуоресцентный ген, кодирующий белки, окруженный транспозонными плечами Tol2.

Осторожно введите раствор для микроинъекций в цитоплазму эмбриона рыбки данио. Внутри клетки мРНК Tol2-транспозазы транслируются в белки Tol2-транспозазы и активно транспортируются в ядро.

Сайты Tol2 на донорской плазмиде содержат специфические инвертированные концевые повторы, или ITR, фланкирующие репортерный ген. РМЭ окружены короткими прямыми повторами. Белки транспозазы распознают и связываются с сайтами ITR, образуя шпильку на фланкирующей ДНК. Транспозазы далее расщепляют конструкцию транспозона от фланкирующей ДНК, высвобождая ее из плазмиды и оставляя после себя короткие прямые повторы.

Транспозазы создают ступенчатый двухцепочечный разрыв в геноме соматической клетки и встраивают конструкцию транспозона в сайт генома. Заполнение зазоров ступенчатых концов ДНК-полимеразой с последующим лигированием зазубрин создает короткие прямые повторы.

Лигирование вызывает стабильную интеграцию транспозонной конструкции в геном соматической клетки, а промотор способствует экспрессии флуоресцентных белков. Инкубируйте введенные эмбрионы. Во время эмбрионального развития соматические клетки дают начало различным типам клеток и создают трансгенных рыбок данио.