Транспозон-опосредованное редактирование генов PiggyBac в ИПСК человека: процедура интеграции интересующего гена в ИПСК человека с использованием транспозонной системы PiggyBac

Начните с суспензии индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, ИПСК, в подходящем буфере для электропорации. Добавьте раствор, состоящий из плазмид, кодирующих транспозазу PiggyBac, и донорских плазмид. Электропорировать смесь.

Электрические импульсы временно проникают в клеточные мембраны, способствуя клеточному поглощению плазмид. Донорские плазмиды содержат транспозон-специфичные инвертированные концевые повторы, ITR, которые являются инвертированными комплементами друг друга, окруженными TTAA-повторами, заключающими в скобки целевой белок и гены устойчивости к антибиотикам.

Экспрессированные белки транспозазы PiggyBac создают зазубрины на 3'-концах ITR, внутренние по отношению к TTAA-повторам. Обнаженные 3'-гидроксильные группы атакуют нуклеотид комплементарной цепи внутри фланкирующей ДНК, образуя шпильки TTAA на концах транспозонов, тем самым высвобождая конструкцию транспозона из плазмиды.

Транспозазы разрешают шпильки с образованием выступов TTAA на 5' концах конструкции транспозона. Транспозазы в дальнейшем создают двухцепочечные разрывы в последовательности TTAA в геноме хозяина. Высвобожденные концы 3'-гидроксильного транспозона атакуют последовательность TTAA на ступенчатых концах, что приводит к ковалентному присоединению конструкции транспозона к геному хозяина, оставляя одноцепочечные промежутки, фланкирующие конструкцию транспозона. Эти пробелы в ДНК хозяина лигируются, что приводит к стабильной интеграции транспозонной конструкции.

Обрабатывайте ИПСК посевом на пластине, покрытой белком внеклеточного матрикса, антибиотикосодержащими средами. Ген устойчивости к антибиотикам, управляемый восходящим промотором, позволяет отбирать генетически отредактированные клетки.