CRISPR Concatemer-опосредованный нокаут нескольких генов: метод одновременной нокаутации нескольких генов по немумологичному пути соединения концов в клетках кишечника мыши

Чтобы одновременно нокаутировать несколько генов с помощью системы CRISPR-concatemer-Cas9, начните с пробирки, содержащей суспензию кишечных клеток мыши. Дополните пробирку векторами CRISPR-concatemer, содержащими экспрессирующую кассету для нескольких направляющих РНК или гРНК, интегрированных рядом друг с другом.

Каждая кассета с гРНК специально разработана для индивидуального нокаутирования нужного гена. Добавьте в ту же пробирку векторы экспрессии, кодирующие эндонуклеазу Cas9. Электропорация клеточно-плазмидной смеси – методика, при которой используется электрический ток для облегчения проникновения плазмид в клетку. Внутри клетки совместная экспрессия CRISPR-конкатемера и вектора Cas9 образует последовательности гРНК и нуклеазы Cas9 соответственно.

Каждая последовательность гРНК связывается с соответствующим ферментом Cas9, образуя множественные комплексы Cas9-гРНК, которые прикрепляются к целевым участкам в геноме хозяина. Это связывание активирует фермент Cas9, который производит разрыв в обеих цепях ДНК вверх по течению к протоспейсерному соседнему мотиву, или сайту PAM. Это приводит к двухцепочечному разрыву, или DSB, в целевой ДНК.

В отсутствие какой-либо гомологичной последовательности к гену-мишени запускается эндогенный механизм репарации клетки, называемый негомологично соединением концов, что позволяет белкам репарации и молекулам киназы связываться в месте разрыва. Позже фермент лигаза восстанавливает DSB, что приводит к модификации последовательности гена-мишени. Эти модификации нарушают функцию генов, что приводит к нокауту нескольких генов.