Цифровая ПЦР на основе чипа в пробирке для количественного определения однонуклеотидных вариантов

Цифровая полимеразная цепная реакция — или dPCR — полезна для количественного определения однонуклеотидных вариантов — или SNV — мутации, при которой замена одного нуклеотида в определенной позиции в геноме создает две нуклеотидные вариации или аллели.

Чтобы начать количественное определение с помощью метода ПЦР «чип в пробирке», возьмите образец ДНК, содержащий SNV — мутантный аллель и соответствующий аллель дикого типа. Добавьте смесь, содержащую термостабильный фермент ДНК-полимеразу, dNTP и праймеры.

Затем добавьте аллель-специфичные олигонуклеотидные зонды, помеченные репортерами разноцветной флуоресценции, чтобы различать аллели, и молекулу-гаситель. Близость гасителя к репортеру подавляет его флуоресценцию.

Разделите раствор на реакционные камеры микрофлюидного чипа. Каждая камера, содержащая аллель, служит самостоятельным реакционным сосудом.

Поместите трубку с чипом внутрь термоамплификатора, и запустите реакцию. При высокой температуре двухцепочечная ДНК денатурируется на одноцепочечные. Понизьте температуру для отжига грунтов и олигонуклеотидных зондов до их комплементарных областей.

При соответствующей температуре удлинения ДНК-полимераза удлиняет праймеры и расщепляет зонд. Расстояние от гасителя позволяет репортеру излучать флуоресценцию.

Считывание разноцветных флуоресцентных сигналов и создание графика положения для обнаружения камер, содержащих аллели.

Чтобы определить частоту мутантного аллеля — фракции вариантного аллеля — вычислите соотношение камер, содержащих мутантный и дикий тип