Дот-блоттинг для количественной оценки вирусного генома

Чтобы количественно определить вирусную ДНК с помощью анализа дот-блоттинга, начните с выделенной суспензии вирусной ДНК. Обработайте щелочным раствором для денатурации двухцепочечной ДНК на одноцепочечные для последующей гибридизации.

Соберите аппарат для блот-блота с предварительно смоченной капроновой мембраной. Загрузите в скважины денатурированную вирусную ДНК и линеаризованные растворы стандартной плазмидной ДНК. Примените подходящий вакуум, способствующий эффективному переносу отрицательно заряженной вирусной одноцепочечной ДНК и связыванию с положительно заряженной поверхностью мембраны посредством электростатических взаимодействий, образуя точечные узоры.

После прогона промойте мембрану буфером цитрата натрия, что поможет улучшить чувствительность анализа. После сушки подвергните мембрану воздействию ультрафиолетового света, сшивая промокаемую ДНК с мембраной.

Добавьте к мембране термически денатурированный, негетерологичный фрагмент ДНК и специфичную для вирусного генома суспензию радиоактивного зонда ДНК, меченную фосфором, в буфере для гибридизации. Инкубируют, облегчая гибридизацию.

Фрагменты ДНК действуют как блокаторы, связываясь с оставшимися участками мембраны, сводя к минимуму связывание неспецифических зондов. Радиоактивный зонд гибридизуется с комплементарной последовательностью на вирусной одноцепочечной ДНК.

Промойте с помощью промывочного буфера для удаления негибридизированных пробников. Используя систему сканирования люминофорного изображения, количественно оцените радиоактивные сигналы, излучаемые радиоактивными зондами, гибридизованными с вирусным геномом на мембране, чтобы получить сигналы точечного блоттинга.

Исходя из стандартной кривой, интенсивность сигнала каждой точки на мембране может быть использована для расчета количества вирусной ДНК в образце.