5-метилцитозиновый дот-блот для определения степени метилирования ДНК

Метилирование ДНК — это эпигенетическая модификация, которая включает в себя добавление метильной группы к цитозиновому основанию ДНК с образованием 5-метилцитозина. Эта модификация изменяет экспрессию генов.

Чтобы количественно оценить метилирование ДНК с помощью дот-блоттинга, возьмите образцы геномной ДНК, полученные из хондроцитов человека на различных стадиях дедифференцировки, которые демонстрируют различные уровни метилированного цитозина.

Обработайте образцы ДНК гидроксидом натрия — сильной щелочью — и нагрейте их. Эта обработка разрывает водородные связи между двумя нитями ДНК, что приводит к денатурации ДНК. Добавьте ацетат аммония для нейтрализации щелочи, предотвращая чрезмерную деградацию ДНК.

Возьмите нейлоновую мембрану и выделите денатурированные образцы ДНК в виде точек. Отрицательно заряженная ДНК связывается с положительно заряженной нейлоновой мембраной посредством электростатических взаимодействий, в результате чего она покрывается промоканием на твердой основе.

Обработайте промокающую мембрану блокирующим буфером, чтобы предотвратить неспецифическое связывание. Далее добавьте в мембрану антитела против 5-метилцитозина, и инкубируйте. Эти антитела связываются исключительно с метилированным цитозином на ДНК.

Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела, и добавьте вторичные антитела, конъюгированные с хемилюминесцентным ферментом, которые специфически связываются с первичными антителами.

Добавьте на мембрану хемилюминесцентную подложку. Фермент на антителе вступает в реакцию с субстратом, образуя хемилюминесценцию, образуя точки различной интенсивности.

Сфотографируйте мембрану и измерьте интенсивность точек, которая соответствует степени метилирования ДНК в каждом образце.