Количественный точечный блоттинг для оценки целевых белков в тканевом лизате

Количественный точечный блоттинг — или QDB — это полезный метод для количественной оценки концентрации целевых белков в образце. После того, как образец иммобилизован на полимерной мембране, белки могут быть обнаружены с помощью иммуноблоттинга.

Для начала возьмем QDB-планшет — многолуночную пластину с нитроцеллюлозной мембраной, прикрепленной к дну каждой лунки. Добавьте образец — лизат ткани, содержащий целевой белок, — в центр мембраны внутри лунки.

Дайте образцу высохнуть. Целевой белок связывается с мембраной посредством нековалентных взаимодействий.

Добавьте решение для блокировки. Белки в растворе прикрепляются к несвязанным участкам на мембране, предотвращая неспецифическое связывание детектирующих реагентов.

Далее добавьте раствор, содержащий первичные антитела, которые связываются с белком-мишенью в образце. Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела.

Затем добавьте вторичный раствор антитела. Эти молекулы, меченные ферментом пероксидаза, связываются с связанными с белком первичными антителами. Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела.

Наконец, добавьте раствор, содержащий хемилюминесцентную подложку и перекись водорода. Используя перекись водорода, связанная с антителами пероксидаза окисляет субстрат и излучает свет. С помощью планшетного ридера измерьте интенсивность люминесценции образца.

Сгенерируйте стандартную кривую люминесценции с помощью последовательного разведения с известными концентрациями целевого белка. Нанесите измеренное значение люминесценции образца на кривую, чтобы определить целевую концентрацию белка.