Количественный вестерн-блоттинг для оценки уровня экспрессии белка

Количественный вестерн-блоттинг — метод, основанный на нормализации общего белка — полезен для количественной оценки целевых уровней экспрессии белка.

Для начала загрузите лизат тканей в лунки полиакриламидного градиентного геля. Лизат содержит целевой белок вместе с другими клеточными белками.

Запустите гель при соответствующем напряжении для электрофоретического разделения белков образца вдоль градиента. По завершении поместите гель поверх полимерной мембраны передаточной стопки.

Подайте электрический ток для переноса отделенных белков на мембрану. Затем поместите мембрану в флуоресцентное пятно с общим белком. Заряженные молекулы красителя в пятне электростатически связываются со всеми белками на мембране.

Добавьте решение для блокировки. Белки в растворе связываются с мембраной, таким образом. предотвращение неспецифического связывания детектирующих реагентов. Добавьте первичное антитело, связывающееся только с белком-мишенью. Затем добавьте вторичное антитело, меченное флуорофором, которое прикрепляется к первичному антителу.

Возбудите образец лазером. Зарегистрируйте флуоресценцию, излучаемую молекулами красителя общего белка и флуорофорами, связанными с антителами, на соответствующих длинах волн.

Чтобы рассчитать нормализованное значение белковой нагрузки, разделите общий сигнал белка каждой полосы на наибольшее значение. Разделите сигнал целевого белка на соответствующее нормализованное значение нагрузки, чтобы определить относительную экспрессию целевого белка.