Одноклеточный вестерн-блоттинг для определения гетерогенности клеток

Участки воспаления содержат различные иммунные клетки, в том числе моноциты, макрофаги и лейкоциты.

Чтобы идентифицировать гетерогенную популяцию клеток с помощью одноклеточного вестерн-блоттинга, возьмите предварительно гидратированный блоттинг-чип, состоящий из фотоактивируемого полиакриламидного геля, структурированного в виде блоков. Каждый блок имеет многочисленные микроскважины. При разбивке на несколько блоков несколько ячеек захватываются параллельно.

Добавьте суспензию, содержащую гетерогенную популяцию клеток. Размеры скважины позволяют оседать отдельным ячейкам. Погрузите чип в камеру для электрофореза, заполненную соответствующим буфером. Молекулы детергента в буфере разрушают клеточную мембрану, высвобождая клеточное содержимое.

Приложите электрическое поле. Высвобожденные белки мигрируют по гелю, разделяясь на полосы различного размера. Промойте чип промывочным буфером, чтобы удалить неспецифически связанные молекулы, оставив только клеточные белки, в том числе нужные белки-маркеры.

Подвергайте гель воздействию ультрафиолета, активируя его поверхность и обездвиживая белки.

Добавьте коктейль первичных антител, которые специфически связываются с маркерными белками, характерными для каждого типа клеток, образуя комплексы белок-первичные антитела. Диспенсируйте смесь флуоресцентно меченных вторичных антител, которые связываются с соответствующими первичными антителами, мечая соответствующий клеточно-специфический маркерный белок.

Поместите чип в сканер. Измерьте интенсивность флуоресценции, которая пропорциональна уровню экспрессии соответствующего белкового маркера, специфичного для отдельной клетки суспензии образца клетки.