Саузерн-блоттинг для выявления гомологичной рекомбинации в геноме эмбриональных стволовых клеток мыши

Саузерн-блоттинг включает в себя идентификацию конкретных последовательностей ДНК из сложной смеси ДНК с помощью зондового обнаружения.

Для идентификации гомологичной рекомбинации или событий HR в эмбриональных стволовых клетках мышей с помощью Саузерн-блоттинга получают геномную ДНК из клеток. Инкубируйте с ферментом рестрикции, чтобы переварить ДНК на более мелкие фрагменты.

Загрузите ДНК на агарозный гель. Выполните электрофорез для разделения фрагментов по размеру.

Обработайте гель кислым раствором для удаления пуриновых оснований, разрыхлив двухцепочечную ДНК, дцДНК. Добавьте щелочной денатурирующий раствор. Высокий pH разрушает водородные связи, денатурируя разрыхленную дцДНК в одноцепочечную ДНК, одноцепочечную ДНК. Инкубируйте с нейтрализующим раствором для нейтрализации рН геля.

Соберите систему переноса с помощью промокательной бумаги, нейлоновой мембраны и геля, уложенных поверх мембраны. Выполните перенос. Одноцеклеотидная ДНК передается из геля на мембрану за счет нисходящего капиллярного действия.

Облучают мембрану ультрафиолетовыми лучами, сшивая и обездвиживая ДНК. Поместите мембрану в пробирку, содержащую раствор для гибридизации. Инкубируйте с вращением, покрывая мембрану и предотвращая неспецифическое связывание зонда.

Наконец, инкубируйте мембрану с буфером для гибридизации, содержащим одноцепочечные радиоактивно меченые зонды. Зонды связываются с определенными участками ДНК через комплементарность последовательностей.

Промойте мембрану, удалив развязанные щупы. Подвергайте мембрану воздействию рентгеновских лучей. Отчетливые полосы на мембране отличают участки ДНК, содержащие события HR, от контрольных областей.