Цифровая ПЦР на основе чипа в пробирке для количественного определения однонуклеотидных вариантов

Добавьте ранее разработанные праймеры, зонды и геномную ДНК в новую полоску из 8 пробирок, чтобы получить общий объем 15 микролитров. Пипеткой вверх и вниз перемешивайте.

Добавьте загрузочную платформу на стружку, встроенную в свежую 8-трубную полосу, а затем поместите трубную полосу в автозагрузчик. Убедитесь, что между стружкой и погрузочной платформой есть контакт. Затем поместите загрузочный слайдер на платформу и с помощью стопора удерживайте слайдер от погрузчика. Нанесите пипеткой 15 микролитров ПЦР-смеси возле кончика ползунка, а затем, нажав кнопку загрузчика, запустите загрузчик на 1 минуту.

Снимите трубную полосу с погрузчика после пробега и поместите ее в усилитель герметизации. Осторожно надавите на горную крышку и край верхней крышки. Запустите усилитель герметизации примерно на 2 минуты. Если герметизация неполная, о чем свидетельствует лужа жидкости, повторите прогон еще минуту.

Добавьте в трубки 230 микролитров герметизирующей жидкости. Поместите полоску пробирки в термоамплификатор и запустите ПЦР, как описано в протоколе. Если наблюдается неравномерное распределение положительных разделов, отрегулируйте температуру или продолжительность ПЦР.

Чтобы обнаружить и проанализировать интенсивность флуоресценции продуктов ПЦР, поместите полоску пробирки на приспособление для обнаружения и добавьте 6 миллилитров дистиллированной воды. Удалите все видимые пузырьки воздуха с помощью наконечника для дозатора.

Загрузите приспособление в детектор. В программном обеспечении для обнаружения выберите вкладки «Флуоресценция», «Эксперимент», а затем «Образец/NTC» и нажмите кнопку «Выполнить», чтобы начать запуск. После завершения прогона подтвердите график положения, гистограмму и 2D-диаграмму рассеяния.

Чтобы собрать продукт ПЦР, удалите герметизирующую жидкость из пробирки. Добавьте 100 микролитров TE-буфера и энергично ворксируйте в течение 30 секунд. Кратковременно центрифугируйте пробирки в настольной центрифуге и действуйте, как описано в текстовом протоколе, до завершения сбора продукта ПЦР.