Количественный вестерн-блоттинг для оценки уровня экспрессии белка

Для электрофореза установите предварительно отлитый от 4 до 12% градиентного геля Bis-Tris в системе камер для гель-электрофореза и загрузите в лунку 3,5 микролитра стандартного белка. При использовании внутреннего стандарта для нормализации между мембранами загрузите количество, равное другим образцам, в первые три лунки рядом с белковой лестницей, и загрузите по 30 мкг каждого образца в остальные лунки. Затем пропустите образцы через укладывающий гель при напряжении 80 вольт в течение 10 минут, а затем при напряжении 150 вольт еще от 45 до 60 минут.

В конце электрофореза, чтобы собрать передаточный стек, поместите белковый гель на нижний стек, содержащий мембрану из поливинилидендифторида, а затем на фильтровальную бумагу. Используйте промокательный валик, чтобы удалить пузырьки воздуха, и поместите верхнюю стопку на верхнюю часть фильтровальной бумаги, прежде чем снова свернуть стопку, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Перенесите всю стопку в передаточное устройство с электродом с левой стороны устройства и поместите гелевую губку поверх стопки так, чтобы губка была выровнена с соответствующими электрическими контактами на устройстве.

После закрытия крышки выберите и запустите соответствующую программу. В конце программы разрежьте мембрану до гелевого размера и быстро промойте разрезанную мембрану водой двойной дистилляции, прежде чем продолжить окрашивание общим белком.

Для полного окрашивания белка сверните мембрану в 50-миллилитровую трубку белковой стороной внутрь и пометьте мембрану 5 миллилитрами раствора для окрашивания белка на валике в течение 5 минут при комнатной температуре в вытяжном шкафу.

По окончании инкубации быстро промойте мембрану 5 миллилитрами промывочного раствора, ненадолго возвращая трубку на ролик между промывками, с последующим кратковременным промыванием ультрачистой водой. Добавьте к мембране 3 миллиметра блокирующего буфера, и верните мембрану на ролик на 30 минут при комнатной температуре. Замените блокирующий буфер первичным антителом, представляющим интерес, в соответствующей оптимизированной концентрации и инкубируйте мембрану на ролике в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.

На следующий день промыть мембрану 6 раз по 5 минут с 5 миллилитрами свежего PBS на одну стирку на валике при комнатной температуре. После последней промывки инкубируйте мембрану с соответствующим раствором вторичного антитела на ролике в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем 3 промывки в течение 30 минут на промывку. После последней стирки высушите мембрану и используйте алюминиевую фольгу, чтобы защитить мембрану от света.

Чтобы получить изображение, поместите мембрану на сканер стороной белка вниз и выберите область сканирования в программном обеспечении. Затем получите изображения в обоих каналах и экспортируйте изображения в соответствующую программу анализа изображений.

Отобразите 700-нанометровый канал, чтобы показать общий результат окрашивания белка, выберите «Анализ» и нарисуйте прямоугольник, чтобы определить область интереса для нормализации. Затем скопируйте и вставьте первую область прямоугольника в каждый отдельный образец, чтобы убедиться, что определенная область имеет одинаковый размер для всех анализируемых полос.

Чтобы количественно оценить концентрацию белка в каждой полосе, скопируйте результаты как общего окрашивания белка, так и интересующего белка в программу для электронных таблиц, а также определите самый высокий сигнал общего окрашивания белка. Затем разделите каждое общее значение сигнала окрашивания белка на это значение, чтобы получить нормализованное значение загрузки белка, и разделите значение сигнала 800 нанометров от каждого отдельного образца на соответствующее нормализованное значение белка, чтобы рассчитать относительный коэффициент экспрессии белка в разных образцах.