Саузерн-блоттинг для выявления гомологичной рекомбинации в геноме эмбриональных стволовых клеток мыши

Для каждой гДНК смешайте 30 микролитров 10-кратного буфера для Dra I, три микролитра Dra I и 10 микрограммов гДНК на образец. Добавляйте воду до тех пор, пока конечный объем не составит 30 микролитров, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи, чтобы переварить гДНК.

Приготовьте 1% агарозный гель для электрофореза с бромидом этидия. Загрузите ранее полученные образцы вместе с лестницей на 1 Кб в гель и запустите его при напряжении от 30 до 40 вольт на ночь. На следующий день замочите гель в лотке, содержащей 0,2 Ньютона раствор соляной кислоты. С помощью шейкера осторожно встряхивайте поднос в течение 20 минут при комнатной температуре.

Переложите гель в лоток с раствором ДНК-денатурирующего раствора. Аккуратно встряхните его в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем переложите гель в лоток с нейтрализующим ДНК раствором и осторожно встряхните его в течение 20 минут при комнатной температуре. Используя систему быстрого нисходящего переноса, перенесите ДНК из геля на мембрану.

Затем соберите TurboBlotter и промокательный стек, как указано в инструкции, предоставленной производителем. После этого выньте мембрану и промойте ее 2Х солевым цитратом натрия в течение одной минуты. Впитайте жидкость в ткани, а затем используйте УФ-сшиватель для сшивания ДНК с мембраной.

Чтобы начать мечение ДНК-зондов с помощью радиоактивности, добавьте термоденатурированные зондовые ДНК в пробирку, содержащую готовые к использованию бусины для маркировки ДНК. Перемешайте пипеткой вверх и вниз и добавьте 5 микролитров радиоактивно меченого дезоксицитозинтрифосфата. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение пятнадцати минут. Очистите промаркированные щупы с помощью микроколонок G-50 в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем. Используйте сцинтилляционный счетчик для измерения радиоактивности.

Чтобы начать гибридизацию мембран с помощью помеченных зондов, поместите мембрану в гибридизационную трубку. Добавьте смешанный раствор для предварительной гибридизации. Поместите трубку в печь для гибридизации и дайте предварительной гибридизации продолжаться при температуре 42 градуса Цельсия в течение 30 минут.

Затем выньте трубку из духовки, и налейте раствор предварительной гибридизации в 50-миллилитровую трубку. Добавьте денатурированный щуп и аккуратно перемешайте. Добавьте смешанный раствор для гибридизации в трубку для гибридизации и верните трубку в печь для гибридизации. Затем дайте гибридизации продолжаться в течение ночи.

Чтобы удалить негибридизованные зонды, поместите мембрану в лоток, содержащий 1x цитрат физиологического раствора и натрия с 0,1% SDS, и осторожно встряхните при температуре от 55 до 60 градусов Цельсия в течение 10 минут. После этого оберните мембрану полиэтиленовой пленкой, и закрепите ее в экспонировании кассеты. В темном помещении выставьте на мембрану 2 листа рентгеновской пленки. Проявите пленку, чтобы визуализировать результаты.