Сотрудничество культуры Модели Синегнойной палочки Биопленки выращенных на живые человеческие клетки дыхательных путей

Эта статья описывает различные методы выращивания

Общая цель этой процедуры заключается в выращивании биопленок pseudomonas aerogen на апикальной поверхности живых эпителиальных клеток дыхательных путей человека. Это достигается путем создания сливающегося монослоя эпителиальных клеток дыхательных путей на пластиковой поверхности или стеклянной крышке. Вторым этапом процедуры является выращивание культуры p-аэрогенных бактерий конститутивно, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок.

Следующим шагом является помещение бактерий и клеток дыхательных путей в контакт друг с другом либо в статической среде, либо в проточной камере. Заключительный этап процедуры заключается в том, чтобы позволить бактериальным биопленкам развиваться с течением времени, оценивая жизнеспособность клеток дыхательных путей. С помощью флуоресцентной микроскопии можно получить результаты, которые показывают образование биопленки на живых клетках дыхательных путей.

Применение этого метода распространяется на терапию пациентов с муковисцидозом, поскольку эти модели сокультур могут быть использованы для разработки и валидации новых схем антибиотиков, способных уничтожить биопленки, ответственные за хроническую колонизацию дыхательных путей. У пациентов с муковисцидозом в статической модели биопленки с совместной культурой используются клетки CFBE, которые являются иммортализованными дыхательными путями человека. Эпителиальные клетки, первоначально развившиеся у человека с муковисцидозом за 7-10 дней до бактериального инокуляционного посева, засеивают клетки CFBE в 24-луночной тканевой культуральной пластине.

Мы высеваем клетки в концентрации от двух до 10 до пятых клеток на лунку по 0,5 миллилитров минимальной эфирной среды или МЕМ с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки двух миллимолярных L-глутамина, 50 единиц на миллилитр, пенициллина и 50 микрограмм на миллилитр. Стрептомицин выращивает клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. 95% воздуха в течение 7-10 дней меняйте среду каждые два-три дня.

Эти условия приведут к образованию сливающихся, монослойных и плотных соединений за сутки до эксперимента. Инокулируйте пятимиллилитровую культуру LB с пьерогеном из замороженного подвойя и выращивайте 18 часов при 37 градусах Цельсия на ротаторе. При 200 об/мин мы используем p-аэроген, несущий плазмиду PSMC 21, для конститутивной экспрессии GFP в день бактериального посева.

Удалите среду из клеток CFPE и добавьте равный объем среды для микроскопии, которая представляет собой MEM без фенольного красного, дополненную двумя миллимолярными L-глутаминовыми инокуляционными конфлюенциями, монослоями CFBE с позой при кратности инфекции примерно 30 к одному относительно количества клеток CFBE, первоначально засеянных для 24-луночного планшета. Это равняется 1,2 умножить на 10 седьмых КОЕ на миллилитр на 0,5 миллилитра МЕМ на 1. Хорошо инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, 95% воздуха в течение одного часа.

После часовой инкубации удалите сныть и замените ее свежей микроскопией. Среда дополнена 0,4%-ным аргинином. Добавление аргинина задерживает разрушение монослоя на достаточно долгое время, чтобы на клетках CFPE образовались биопленки.

Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, 95% воздуха в различные моменты времени примерно до восьми часов каждые пару часов. Проанализируйте целостность монослоя CFBE и рост биопленки с помощью микроскопии. Модель биопленки для совместной культивирования проточных клеток требует формирования сливающегося монослоя клеток CFBE на стеклянном покровном стекле диаметром 40 мм.

Для этого в первую очередь в стерильную пластиковую посуду диаметром 60 мм помещают стерильную крышку. Затем добавьте три миллилитра предварительно прогретых клеток для роста клеток, слегка надавливая на крышку кончиком пипетки, чтобы удалить любые пузырьки, попавшие под нее, и с силой прижать крышку к дну пластиковой чашки для семян, два раза по 10 до шестой клетки CFBE на чашку. Осторожно встряхивайте чашку вперед и назад, но избегайте закручивания, чтобы не допустить центрифугирования ячеек по бокам чашки.

Поместите чашку в воздушный инкубатор с 5% углекислым газом и 95% при температуре 37 градусов Цельсия на восемь-10 дней. Подкармливайте клетки через день тремя миллилитрами свежей питательной среды. В этих условиях ячейки образуют сливающийся монослой на стекло покровного стекла.

Следующим шагом является подготовка бактериального штамма P aerogen за день до эксперимента. Вырастите p аэроген в пяти миллилитрах LB в течение 18 часов при 37 градусах Цельсия на ротаторе. При 200 об/мин мы используем штамм P aerogen, PO one, несущий плазмиду PSM C 21 для конститутивной экспрессии GFP в день эксперимента.

По одному миллилитру бактериальной культуры в стерильную микроцентрифужную пробирку и центрифугировать при 6 000 об/мин в течение трех минут. Промойте бактериальную гранулу дважды в одном миллилитре микроскопии. Среду разведите 0,5 миллилитра промытых и ресуспензионных бактерий в 4,5 миллилитрах микроскопической среды до достижения концентрации примерно в пять раз 10 восьмых КОЕ на миллилитр.

Теперь мы готовы наблюдать за клетками CFPE в режиме реального времени, для чего требуется камера визуализации, соединенная с перистальтическим насосом, чтобы обеспечить поток питательных веществ в течение длительного периода времени. И терморегулятор, мы используем стандартный биопленочный проточный клеточный аппарат. Биотехнологии FCS двухкамерные модифицированы для размещения клеток CFPE.

Одним из наиболее важных этапов в модели биопленки для совместной культуры проточной клетки является сборка камеры без повреждения клеточного монитора Для сборки камеры. Держите верхнюю половину камеры вверх дном так, чтобы были видны перфузионные трубки, и совместите отверстия для зазора резиновой прокладки толщиной 0,75 мм с перфузионными трубками. Установите затвор микроакведука, входящий в комплект поставки камеры, на верхнюю часть резиновой прокладки, убедившись, что рифленая сторона находится вверх.

Затем поместите еще одну резиновую прокладку поверх горла. Толщина и внутренняя геометрия этой второй прокладки будут определять объем камеры. Далее добавьте один миллилитр предварительно подогретого микроскопического средства в центр предметного стекла.

Поместите камеру визуализации на стерильную поверхность, пока вы извлекаете клетки CFPE из инкубатора для клеточных культур. Извлеките отработанную среду из посуды и промойте клетки CFPE один раз тремя миллилитрами предварительно подогретой микроскопической среды. С помощью этанола промывают щипцами.

Достаньте крышку из чашки и опустите ее вверх дном на шарик микроскопического материала, помещенный на камеру. Защитное стекло теперь опирается на вторую резиновую прокладку, а монослой элементов дыхательных путей направлен вниз. Держа собранные компоненты в одной руке, поместите основание камеры на верхнюю часть стопки и быстро переверните камеру так, чтобы все было правильной стороной вверх.

Зафиксируйте основание на месте, повернув кольцо. Подсоедините впускную трубку к микроперфузионному насосу с низким расходом. Второй кусок трубки соединяет насос с микроскопической средой, помещенной в водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия.

Расположен прямо рядом с микроскопом. Начните подачу со скоростью 20 миллилитров в час. Этот расход находится в пределах скорости плавания posa.

Прикрепите стерильную предварительно обрезанную одну 16-ю КЛЛ трубку к входной и выходной перфузионным трубкам камеры, а затем подключите регулятор температуры. Поместите собранную камеру на предметный столик инвертированного флуоресцентного микроскопа. С помощью одноразового шприца объемом в один миллилитровый.

Введите предварительно приготовленную бактериальную суспензию в камеру с помощью двустороннего клапана, расположенного на одной линии между насосом и камерой, чтобы позволить бактериям прикрепиться к клеткам дыхательных путей. Остановите насос на два часа. Через два часа поток можно возобновить и поддерживать на уровне 20 миллилитров в час.

В течение оставшейся части эксперимента контролируйте целостность клеток дыхательных путей с помощью дифференциальной интерференции. Контрастная микроскопия на протяжении всего эксперимента проверяется на наличие признаков повреждения монослоя. Одновременно проследите за развитием меченных GFP p-аэрогенных биопленок на апикальной поверхности клеток дыхательных путей.

Путем получения изображений с помощью инвертированного конфокального или широкопольного флуоресцентного микроскопа как в статическом, так и в проточном анализе было обнаружено, что монослой CFPE может выдерживать присутствие p-аэрогена в течение восьми часов после инокуляции без каких-либо признаков изменения. Целостность эпителиального монослоя может быть оценена с помощью фазово-контрастной микроскопии с использованием инвертированного, как показано на этом примере сливающегося монослоя клеток CFPE, выращенных на планшетах для культуры тканей. Со временем p-аэроген будет вырабатывать токсины и факторы вирулентности, которые могут повредить монослой эпителиальных клеток полностью или по частям.

В этом примере скомпрометированного монослоя CFPE видно, как бактерии P-aerogen, показанные зеленым цветом, распространяются между плотными соединениями эпителиальных клеток и получают доступ к базолатеральным мембранам. Образование биопленки в этих условиях обычно не достигается из-за ухудшения состояния монослоя. На этом изображении показана разросшаяся биопленка p-аэрогена, наблюдаемая через 24 часа после инокуляции после успешного поддержания образования биопленки.

Монослой CFPE был поврежден и в настоящее время практически отсутствует. Остаточная биопленка, растущая в виде плоского слоя бактерий, прикрепляется к стеклянной крышке. При этом целостность однослойного слоя дыхательных путей не нарушается.

Биопленки P-аэрогена могут успешно образовываться и развиваться на апикальной поверхности клеток дыхательных путей в обеих моделях совместного культивирования. Здесь показано репрезентативное изображение биопленки A GFP, экспрессирующей p-аэроген, выращенной на сливающемся монослое клеток CFPE с использованием статической модели биопленки ко-культуры, оцененной с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Изображение представляет собой наложение канала контраста лица и канала флуоресценции.

На следующем изображении показан GFP с меткой p аэроген. Биопленка выращивалась в течение шести часов на сливающемся монослое клеток CFBE с использованием модели биопленки с совместной культурой проточных клеток для облегчения визуализации дыхательных путей. Монослойные ядра окрашивали HEXT 3, 33, 42 перед инокуляцией позой и имели синий цвет.

Пленки, представленные в виде зеленых комков, прикрепленных к апикальной поверхности клеток CFPE, диспергируются по клеткам дыхательных путей. Показаны типичные грибовидные структуры биопленок аэрогена шестичасовой давности, формирующиеся на монослое клеток A-C-F-P-E после 3D-реконструкции. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как успешно выращивать и визуализировать бактериальные биопленки на установленном монослое клеток дыхательных путей с использованием описанных здесь моделей совместной культуры в сочетании со стандартными микробиологическими методами и флуоресцентной микроскопией.