Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

Целью этой процедуры является экспрессия функциональных антиген-специфических Т-клеточных рецепторов на Т-клетках мыши. Во-первых, трансфектируют линию клеток, продуцирующих ретровирусы, плазмидой, содержащей интересующий ген TCR, в упаковку TCR, экспрессирующего ретровирус. Затем изолируйте и очистите Т-клетки из селезенки мыши, инфицируйте эти очищенные Т-клетки ретровирусом, полученным на первом этапе.

Наконец, размножите трансдуцированные Т-клетки для экспрессии и получения заметных уровней рецептора. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают экспрессию функциональных антиген-специфических TCR на Т-клетках мыши с помощью проточной цитометрии. Здравствуйте, меня зовут Мишель Кроу Гард.

Я учусь в Институте рака Нью-Йоркского университета при Медицинской школе Нью-Йоркского университета. Сегодня мы покажем вам, как трансдуцировать первичные Т-клетки, люди, которые покажут вам, как это сделать, будут Шионг, постдок в лаборатории, Калина Мелек, аспирант в лаборатории, и Ариан Перес Гарсия, постдок в лаборатории. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как у трансгенных мышей, заключается в том, что она гораздо менее трудоемка.

Этот метод может помочь ответить на ключевые иммунологические вопросы, например, какой TCR может дать лучший ответ против антигенов. Эта методика может быть применена для адоптивной терапии переноса Т-клеток, которая, как было показано, перспективна для лечения онкологических больных и заключается в модификации in vitro Т-клеток человека для обеспечения равной экспрессии альфа- и бета-цепей Т-клеточных рецепторов. Субклонировать интересующий ген в тот же ретровирусный вектор под контролем того же промотора.

Подготовьте высококачественную плазменную ДНК с помощью подготовительного набора Kyogen Maxi и сделайте запас из расчета один микрограмм на микролитр. Удалите носитель с пластины с помощью ретровирусных упаковочных ячеек из платины E и промойте пластину один раз одним XPBS. Вытесните клетки, добавив трипсин ЭДТА, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение нескольких минут.

Нейтрализуйте смещенные клетки средой DMEM и переложите в соколиную трубку. Затем центрифугируйте ячейки при 1000 G в течение пяти минут. Аспирируйте супинат и ресуспендируйте клеточную гранулу в среде DMEM.

Определите количество клеток и разбавьте клетки в соотношении 0,6 умножить на 10 к шести на миллилитровую пластину. 10 миллилитров клеточной суспензии поместите в 10-миллиметровую тканевую культуральную пластину, покрытую полилизином, и вырастите в течение ночи в клеточном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе. На следующее утро исследуйте клетки под световым микроскопом, чтобы убедиться примерно в 80% беглости звука.

Аккуратно снимите носитель с пластины. Промойте клетки один раз одним XPBS и добавьте 10 миллилитров предварительно подогретой свежей среды DMEM без пенициллина или стрептомицина. Для среднего трансфекционного комплекса для губ приготовьте две смеси и уравновесьте ME M1 ДНК и другой реагент липэктомии отдельно в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем аккуратно перемешайте и выдерживайте в течение 20 минут. При комнатной температуре медленно капните смесь в платиновые Е-клетки. Осторожно покачивайте пластину вперед и назад, чтобы равномерно распределить трансфекционную смесь.

Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в клеточном инкубаторе. Через шесть-восемь часов замените среду на 10 миллилитров свежей среды DMEM для производства вируса. Соберите мышиную селезенку и переложите в среду RPMI.

Поместите селезенку в клеточное ситечко. Разомните селезенку с помощью поршня шприца в пятисантиметровую тарелку для культуры тканей. Промойте клетки с клеточного фильтра стерильным PBS, чтобы центрифугировать клетки при 1000-кратном G в течение пяти минут.

Выбросьте суп натан. Продолжайте с помощью Resus, суспендируя клеточную гранулу в лизирующем буфере CK. Добавив по два миллилитра на селезенку, выдержать в течение двух минут.

При комнатной температуре. Добавьте среду RPMI до 20 миллилитров и центрифугируйте при 1000-кратном G в течение пяти минут. Наконец, повторно суспендируйте клеточную гранулу в стерильной PBS.

Определите номер ячейки и центрифугируйте при 1000 умноженных на G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. С целью активации Т-клеток мыши перед вирусной трансдукцией оборудуют пластины с активирующими антителами, а именно анти-CD-три-эпсилон и анти-CD-28. Приготовьте смесь антител из одного микрограмма на миллилитр анти-CD, трех эпсилонов и двух микрограммов на миллилитр анти-CD 28 в стерильном PBS, распределите 250 микролитров смеси антител в каждую лунку 24-луночного планшета для культуры тканей и инкубируйте в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия.

Нанесите магнитную маркировку на клетки селезенки в соответствии с инструкцией по продукту. Поместите столбец LS в магнитное поле. Нанесите на столбец суспензию размеченных ячеек.

Сбор потока через обогащенные мышиные CD восемь плюс Т-клеток. Промойте колонку трижды тремя миллилитрами буфера и соедините с предыдущей продувкой. Окрашивают клетки анти-CD-тремя эпсилон-антителами и анти-CD-восемью альфа-антителами и анализируют проточную цитометрию.

Затем центрифугируйте клетки при 1000-кратном G в течение пяти минут и ресуспендируйте клеточную пелле до 1 миллиона клеток на миллилитр в среде RPMI с рекомбинантным человеческим IL 2. Удалите раствор антитела с активационной пластины. Промойте каждую лунку стерильным PBS.

Добавьте по одному миллилитру клеточной суспензии в каждую лунку и поместите тарелку при температуре 37 градусов Цельсия. 5% углекислого газа в клеточный инкубатор. После двух дней производства вируса среда в платиновой клеточной пластине ESE должна стать желтой.

Перенесите вирусный супинат в коническую трубку объемом 15 миллилитров, чтобы удалить клеточный мусор. Центрифугируйте супернатант вируса S в 1000 раз G в течение пяти минут. Осторожно перенесите вирус супинат в новую трубку.

Оставьте немного жидкости на дне пробирки и не тревожьте клетки остатками. Соберите активированные Т-клетки из пластины в 50-миллиметровую коническую трубку. Определите номер ячейки.

Сохраните несколько клеток в отдельной пробирке для использования в качестве центрифуги отрицательного контроля при 1000-кратном G в течение пяти минут и выбросьте лежачий натант. Затем ресуспендируйте клеточную гранулу в положении лежа на спине вируса. Натант в соотношении от 10 до шести клеток на миллилитр с 20 нанограммами на миллилитр рекомбинантного человеческого, интерлейкином 2 и 10 микрограммами на миллилитр белкового сульфата.

Добавьте по одному миллилитру клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночного планшета для контрольной трубки. Ресус. Суспендировать клетки в среде RPMI при той же плотности клеток с тем же количеством рекомбинантного человеческого вещества, интерлейкина-2 и сульфата белка. Добавьте ячейки в одну и ту же тарелку.

Оберните тарелку полиэтиленовой пленкой центрифуги на 90 минут при температуре 2000 раз G при 32 градусах Цельсия без разрыва. После центрифугирования снимите полиэтиленовую пленку. Добавьте по одному миллилитру свежей среды RPMI с 20 нанограммами на миллилитр рекомбинантного человеческого интерлейкина по два в каждую, хорошо поставьте тарелку обратно в инкубатор.

Важно ежедневно обследовать трансдуцированные Т-клетки. При необходимости разделите ячейки в соотношении от одного до трех. Не позволяйте клеткам разрастаться или позволять среде пожелтеть на шестой или седьмой день.

Окрашивание клеток антителами и тетрамером MHC, специфичным к TCR, для оценки экспрессии TCR на поверхности Т-клеток. Используйте Т-клетки СОООН в качестве контроля. Эти трансдуцированные Т-клетки теперь готовы к дальнейшему применению.

Перед вирусной трансдукцией. Для оценки уровня экспрессии TCR на Т-клетках целесообразно получать субпопуляции Т-клеток высокой чистоты с использованием коммерческих магнитных шариков. Можно использовать антитела, специфичные для альфа- или бета-цепей TCR.

Как правило, от 30% до 80% клеток могут экспрессировать трансдуцированный TCR в зависимости от генов TCR и титров вируса. Специфичный для TCR MHC Tetramer также может быть использован для дальнейшей проверки функциональной экспрессии TCR. После освоения этой техники ее можно выполнить за одну неделю при правильном выполнении.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что после этой процедуры клетки должны оставаться в здоровом состоянии. Другие методы, такие как анализ цитотоксичности кислоты или высвобождения цитокинов, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как специфичность и чувствительность трансдукции. TCR.

После просмотра этого видео вы должны стать экспертом в трансдукции вашего любимого TCR в первичные Т-клетки. Так что до встречи в лаборатории.