Микроинъекция бактерий в хвостовую вену эмбрионов данио-религии

Возьмите эмбрионы данио-рерио, подвешенные в рыбьей воде, и удалите хорион — защитную оболочку, окружающую эмбрионы.

Переместите эмбрионы в V-образную камеру позиционирования, наполненную рыбьей водой с анестетиком, чтобы обездвижить их для микроинъекции.

Разместить эмбрионы внутри камеры.

Далее разведите однородную суспензию флуоресцентно маркированных патогенных бактерий в буфере с моющими средствами для минимизации скупления бактерий.

Добавьте краситель для облегчения мониторинга инъекции.

Загрузите подвеску в иглу для микроинъекции, закрепите иглу на микроманипуляторе и сломайте кончик, чтобы создать небольшое отверстие.

Переместите эмбрион так, чтобы вентральная сторона была обращена к игле, и подведите кончик иглы к урогенитальному отверстию.

Аккуратно введите кончик в область хвостовой вены и введите бактериальную суспензию.

Переместить эмбрионы в многоколодцевую пластину с водой для последующих исследований взаимодействия хозяина и бактерий.

Для проведения микроинъекции М. Абсцесс примерно через 24 часа после оплодотворения (HPF) используйте пинцет для дехорионизации эмбрионов в чашке Петри диаметром 100 мм и поддерживайте их при температуре 28,5 градусов Цельсия.

Перенесите 30-48 эмбрионов HPF в V-образную камеру позиционирования, заполненную 25 миллилитрами рыбьей воды с 270 миллиграммами на литр трикаина. С обрезанным наконечником микрозагрузчика правильно положите эмбрионы в каналы для облегчения микроманипуляции.

Используйте PBST с 0,05% Tween 80, чтобы разбавить микробактериальный инокулюм до желаемого CFU для доставки, и добавьте 10% фенол-красного для проверки правильной инъекции. С помощью наконечника микрозарядчика загрузите иглу для микроинъекции 5–10 микролитров бактериального инокулюма.

Подключите иглу для микроинъекции к держателю микроманипулятора, подключённого к инжектору, и с помощью тонкого пинцета отломите верхнюю часть иглы, чтобы получить диаметр отверстия от 5 до 10 микрометров.

Калибруйте объём впрыска путём регулировки давления и времени микроинъекции. Затем, чтобы получить необходимый объём инъекции, измерьте диаметр капли, выброшенной в желток одного эмбриона.

Для микроинъекции в хвостовую вену разместите эмбрион так, чтобы вентральная сторона была обращена к игле, и кончик иглы близко к урогенитальному отверстию, аккуратно введите кончик иглы в эмбрион, пока он не проткнет область хвостовой вены.

Затем подают нужный объём бактериальной суспензии, обычно от 1 до 3 нанолитров, содержащих около 100 CFU на нанолитр. Инкубировать и контролировать эмбрионы согласно текстовому протоколу.