Многофотонная изображений опухолевой инвазии сотовый в Ортотопическая Модель мыши устного плоскоклеточный рак

Общая цель данной процедуры заключается в создании мышиной модели рака полости рта, позволяющей визуализировать и количественно оценивать инвазию опухоли в языке. Это достигается путем предварительного получения клеток плоскоклеточного рака полости рта для двухфотонного имиджинга посредством лентивирусной инфекции LifeAct-mCherry и последующего стабильного клонального отбора. Затем в обнаженных мышах (nude mice) создаются ортотопические ксенотрансплантаты путем инъекции клеток, меченных LifeAct-mCherry, в языки анестезированных мышей.

Затем проводится визуализация фрагментов языка с опухолью с помощью двухфотонной микроскопии. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие количественную оценку локальной инвазии опухоли полости рта в мышцы языка посредством двухфотонной визуализации свежей ткани языка и последующей компьютерной трехмерной реконструкции первичных опухолей и регионально инвазировавших клеточных групп. Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как иммуногистохимический анализ или биолюминесцентная визуализация, является возможность количественного измерения инвазии опухолевых клеток в трех измерениях.

Значение данного метода распространяется на терапевтическое вмешательство при раке полости рта, так как он предоставляет модельную систему для анализа белков, участвующих в инвазии опухоли, а также для оценки доклинических соединений в рамках антиинвазивных терапевтических стратегий. Как правило, люди, только начинающие осваивать эту методику, могут столкнуться с трудностями, поскольку инъекция опухолевых клеток в язык и подготовка языка для двухфотонной микроскопии технически сложны и требуют навыков и практики. Визуализация этого метода имеет решающее значение, так как этапы инъекции опухоли и двухфотонной микроскопии трудно освоить, и они требуют специализированных навыков. Для начала культивирования.

Линии клеток опухолей головы и шеи человека в полной среде, состоящей из DMEM с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина и 1% незаменимых аминокислот. Для переноса последовательности кодирования LIFE Act mCherry в лентивирусный вектор pLL 7.0 сначала требуется провести сайт-направленный мутагенез для введения трех сайлентных мутаций в один сайт распознавания SBF1 в родительской кДНК mCherry. Затем с помощью ПЦР амплифицируют модифицированную последовательность Life Act mCherry с фланкирующими сайтами EcoR1 и SBF1 и субклонируют ее в pLL 7.0. Для создания конструкции pLL 7.0 LIFE Act mCherry с использованием лентивирусной экспрессионной системы культивируют упаковочную клеточную линию 293T до достижения 17–40% конфлюэнтности в полной среде.

С помощью CalFoss проведите трансфекцию клеток векторами PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS 2 и P-V-S-V-G в соотношении 3:2:1 соответственно. Через 24 часа замените среду на свежую полную среду; собирайте и обновляйте среду каждые 12 часов в течение 72 часов, храня собранную среду при 4 °C для получения клеточных линий головы и шеи со стабильной экспрессией life Act M cherry. Центрифугируйте собранную среду при 2000 об/мин в течение 10 минут при 4 °C, затем добавьте 1 мл очищенной среды, содержащей вирус, к клеткам OSC 19 или US CCC 1 на 12 часов.

Промойте клетки, затем добавьте еще 1 мл вируса на следующие 12 часов. Культивируйте клетки в среде, содержащей 200 mg/mL пурамицина, в течение двух недель. Для отбора резистентных колоний визуально оцените выжившие колонии на наличие экспрессии m cherry с помощью флуоресцентной микроскопии. После трипсинизации перенесите отдельные положительные колонии с помощью стерильных клонирующих дисков диаметром 3 мм.

Поддерживайте жизнеспособность положительных клеток в среде, содержащей 200 mg/mL пуромицина, до момента их заморозки или использования для ортотопической инъекции с целью создания ортотопического ксенографта опухоли из экспрессирующих M cherry опухолевых клеток. Затем центрифугируйте культуру и ресуспендируйте около 2,5 × 10⁴ клеток в 50 µL полной среды. Загрузите опухолевые клетки в шприц объемом 1 mL, оснащенный иглой 27G длиной 1/2 дюйма.

Затем проведите анестезию восьминедельной самке атимической лисицы (голой мыши), используя комбинацию кетамина в дозе 80 мг/кг и ксилазина в дозе 10 мг/кг. Как только животное перестанет двигаться, нанесите смазывающую глазную мазь и проверьте реактивность, нажав ногтем на подушечку лапы.

Содержите мышей на грелке при температуре от 37 до 40 °C. С помощью стерильного пинцета аккуратно захватите кончик языка и вытяните его из ротовой полости. Медленно введите клетки в одну сторону каждого языка, чтобы создать выпуклую массу в центре языка.

Введите мышам йохимбин в дозе 2,1 мг/кг и поместите их обратно на грелку для наблюдения в период выхода из наркоза. Поместите мышей в стерильные клетки с мягким трансгенным пищевым субстратом. Взвешивайте мышей каждые два-три дня и визуально контролируйте появление опухолей.

Для подготовки языков мышей к визуализации ex vivo эвтаназируют мышей с опухолями в разные моменты времени. После эвтаназии путем вдыхания углекислого газа извлекают языки и промывают их 1XPBS. Затем используют мононить из магазина для рукоделия и швейную иглу размера восемь.

Прикрепите язык к одной стороне стандартной кассеты для заливки тканей парафином. После фиксации языка полностью погрузите кассету в сборе в 1× PBS. Немедленно приступите к исследованию языков с помощью двухфотонной микроскопии для получения их изображений.

Поместите кассеты с языками в чашку диаметром 60 миллиметров с раствором 1X PBS. Закрепите чашку в специально разработанном держателе на выдвижном консольном рычаге, расположенном под объективом двухфотонного микроскопа. Установите водный погружной объектив с увеличением 40x и числовой апертурой 0.8 непосредственно на видимый очаг опухоли или над ним.

Выполните визуализацию языка методом двухфотонной микроскопии с использованием титан-сапфирового лазера с интенсивностью 60 мВт и входной длиной волны 755 нм. Для оптимизации сигнала M cherry снимите серию сканирующих лазерных изображений с шагом 1 мкм на общей глубине ткани от 15 до 100 мкм. При такой конфигурации можно анализировать опухоли глубиной до 1 мм в ткани.

Для получения изображений используйте функцию сканирования изображения. Функция сканирования генерирует двухканальный выход растровых паттернов сканирования для управления гальванометрическими сканирующими зеркалами по осям XY и одновременно регистрирует сигнал с входа (максимум четыре канала) от фотоэлектронных умножителей через плату сбора данных. С помощью сканирования изображения можно собирать Z-стеки путем управления перемещением объектива по оси Z, а также получать изображения в режиме таймлапса в однократном или циклическом режиме.

Сохраните изображения в одном TIF-файле с 16-битной глубиной цвета. С помощью программного обеспечения Amira преобразуйте стеки изображений опухоли в единое трехмерное изображение, открыв TIF-файл, содержащий набор Z-стеков. Для создания трехмерной визуализации используйте функцию TEX.

На полученном изображении, скорее всего, будет присутствовать крупная первичная опухоль и несколько более мелких разобщенных инвазивных групп (ig). Для измерения объема опухоли определите порог площади первичной опухоли и каждого среза стека изображений, скорректируйте и удалите фоновую флуоресценцию. Повторите процедуру установки порога для каждой инвазивной группы.

После выбора первичной опухоли и всех igs определите объем, а также координаты OID опухоли по осям X, Y и Z для первичной опухоли. Чтобы рассчитать расстояние от igs до центральной точки опухоли, вычислите индекс инвазии опухоли или ti по формуле ti = NT × VT × dt, где NT — общее количество igs на изображении, VT — общий объем всех igs, а DT — суммарное расстояние, пройденное всеми инвазивными группами от центра первичной опухоли.

Трехмерные рендеринги с более детальной топографией можно создать, импортировав исходные 16-битные монохромные файлы снимков кончиков в программное обеспечение Nikon NIS-elements. Создайте ND-файл из стека изображений. Затем вручную откалибруйте документ, указав размер пикселя для получения рендерингов более высокого качества.

Добавьте дополнительные срезы в плоскости Z. На этом рисунке представлен пример необработанных данных, полученных с помощью двухфотонного изображения в NIS elements или с использованием зеркального ПО. С помощью данного программного обеспечения можно реконструировать необработанные данные опухолей языка, которые показаны на этом рисунке.

На этой панели показан пример трехмерной визуализации с использованием функции TEX в программном обеспечении Amira. Здесь представлен пример пороговой обработки отдельного двухфотонного среза из стека изображений для идентификации инвазивных групп, отходящих от первичной опухоли, а также центра первичной опухоли или оида. После анализа каждого отсеченного по порогу среза Amira количественно определяет объем и расстояние, пройденное каждой инвазивной группой от центра.

Эти данные могут быть представлены графически и использованы для получения числового значения общего уровня инвазии опухолевых клеток. На рисунке A, относящемся к первичному очагу, представлены репрезентативные изображения опухолей, визуализированные с помощью стандартного патологоанатомического иммуногистохимического окрашивания, в сравнении с трехмерным изображением аналогичной опухоли, полученным с использованием описанного протокола. После освоения всех этапов — от извлечения языка до финального 3D-рендеринга — данная методика может быть выполнена примерно за два часа при условии правильного соблюдения всех шагов. При выполнении этой процедуры следует проявлять осторожность, чтобы не проколоть язык иглой насквозь, так как это может привести к потере опухолевых клеток и затруднить анализ опухоли. После выполнения данной процедуры можно проводить тестирование терапевтических соединений или клеток с модифицированным уровнем белков для определения их эффективности в отношении инвазии при раке полости рта.

При проведении исследований in vivo помните, что работа с клетками опухолей человека, модифицированными лентивирусом, сопряжена с риском; при работе с инъецированными мышами следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование соответствующих СИЗ и работа в сертифицированном ламинарном шкафу уровня BSL-2.