Многофотонная изображений опухолевой инвазии сотовый в Ортотопическая Модель мыши устного плоскоклеточный рак

Всесторонний обзор методов, участвующими в подготовке мышиной модели рака полости рта и количественного мониторинга опухолевой инвазии в язык через многофотонной микроскопии меченых клеток представлена. Эта система может служить в качестве полезной платформой для молекулярной оценка и эффективность препарата по борьбе с инвазивными соединений.

Общая цель этой процедуры заключается в создании мышиной модели рака полости рта, которая позволяет визуализировать и количественно оценить инвазию опухоли в язык. Это достигается путем предварительного создания клеток плоскоклеточной карциномы полости рта для двухфотонной визуализации с помощью лентивирусной инфекции жизни, вишни Акта М и стабильного клонального отбора. Далее ортотопические ксенотрансплантаты образуются у голых мышей путем инъекции меченых вишневых клеток Акта М в языки мышей, находящихся под наркозом.

Затем с помощью двухфотонной микроскопии визуализируются языки, содержащие опухоль. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают количественную локальную инвазию опухоли полости рта в мышцу языка посредством двухфотонной визуализации свежей ткани языка и последующей трехмерной реконструкции первичных опухолей и регионально инвазированных клеточных групп. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как иммуногистохимия или биолюминесцентная визуализация, заключается в том, что инвазия опухолевых клеток может быть количественно измерена в трех измерениях.

Применение этого метода распространяется на терапевтическое вмешательство при раке полости рта, поскольку он обеспечивает модельную систему для анализа белков, участвующих в опухолевой инвазии, а также для оценки доклинических соединений по антиинвазивным терапевтическим стратегиям. Как правило, люди, плохо знакомые с этой техникой, испытывают трудности, так как инъекция опухолевых клеток в язык и подготовка языка к двум фотомикроскопиям являются технически сложными, требующими навыков и практики. Визуализация этого метода имеет решающее значение, поскольку инъекция опухоли в два этапа фотона сложна для изучения и требует специальных навыков.

Опухолевые клеточные линии головы и шеи человека в полной среде, состоящие из DMEM с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина стрептомицина и 1% заменимых аминокислот. Для переноса последовательности вишневого покрытия LIFE Act M в сайт лентивирусного вектора PLL 7.0 сначала необходимо ввести три молчаливые мутации в SBF: один сайт узнавания в родительском mCherry CD NA. Затем ПЦР амплифицируют последовательность mCherry Modified Life Act с фланкированием ECO R на один SBF один сайт и субклонт в PLL 7.0. Для получения конструкции вишни PLL 7.0 LIFE Act M после культивирования системы экспрессии лентивируса, упаковочная клеточная линия 2 9 3 T от 17 до 40% слияния в полной среде.

Используя Cal Foss, трансфектируйте клетки векторами PLL 7.0 LIFE Act M, cherry PS PACS two и P-V-S-V-G в соотношении три к двум соответственно. Через 24 часа замените среду свежей, полной средой, собирайте и пополняйте среду каждые 12 часов в течение 72 часов и храните собранную среду при температуре четыре градуса Цельсия для получения клеточных линий головы и шеи со стабильной экспрессией вишни Act M. Собранную среду открутить при 2000 об/мин в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, добавить один миллилитр осветленной среды, содержащей вирус, в одну ячейку OSC 19 или US CCC one на 12 часов.

Промойте клетки, затем добавьте еще один миллилитр вируса еще на 12-часовой период. Культивировать клетки в среде, содержащей 200 мг на миллилитр пур-мицина, в течение двух недель Чтобы отобрать устойчивые колонии, визуально отсеять выжившие колонии на всю жизнь. Акт экспрессии вишни с помощью флуоресцентной микроскопии трипсина глаз, отдельных положительных колоний с использованием стерильных трехмиллиметровых дисков для клонирования.

Поддерживайте положительные клетки в среде, содержащей 200 мг на миллилитр пур-мицина до тех пор, пока они не замерзнут обратно или не будут использованы для ортотопической инъекции ксенотрансплантата трипсина жизни. М. Вишневые экспрессирующие опухолевые клетки затем центрифугируют культуру и ресуспендируют примерно в 2,5 раза по 10 до 4 клеток в 50 микролитрах полной среды. Загрузите опухолевые клетки в одномиллилитровый шприц, прикрепленный к полудюймовой игле 27 калибра.

Далее обезболивают восьминедельную самку атимической лисы. Одна обнаженная мышь с комбинацией 80 миллиграммов на килограмм кетамина и 10 миллиграммов на килограмм ксилазина. Как только животное перестанет двигаться, нанесите мазь для смазки глаз и проверьте реакцию, вдавив ноготь в подушечку лапы.

Поддерживайте мышей на грелке при температуре от 37 до 40 градусов по Цельсию. С помощью стерильных щипцов аккуратно захватите кончик языка и вытяните его из ротовой полости. Медленно вводите клетки в одну сторону каждого языка, чтобы создать луковичную массу в центре языка.

Введите мышам 2,1 миллиграмма на килограмм йохи и верните их в грелку, чтобы наблюдать за ними во время восстановления после анестезии. Поместите мышей в стерильные клетки, содержащие мягкую трансгенную диету из теста. Взвешивайте мышей каждые два-три дня и наблюдайте за ними визуально на предмет возникновения опухоли.

Чтобы подготовить языки мышей к визуализации ex vivo, усыпляйте мышей, у которых опухоли находились в разные моменты времени. Используя ингаляцию углекислым газом, извлеките языки и промойте их одним XPBS. Затем с помощью монофиламентной швейной нитки из местного магазина для хобби и швейной иглы восьмого размера.

Приложите язычок к одной стороне обычной парафиновой ткани для встраивания кассеты. После того, как язычок будет обездвижен, погрузите всю кассету в один XPBS. Немедленно обработайте языки с помощью двухфотонной микроскопии, чтобы получить изображение языков с помощью двухфотонной микроскопии.

Погрузите кассеты с языком в 60-миллиметровую посуду, содержащую один XPBS. Закрепите чашку в держателе специальной конструкции на выдвижном консольном кронштейне, расположенном под объективом двухфотонного микроскопа. Поместите линзу объектива с числовой апертурой 40 x 0,8 с водяной апертурой непосредственно на видимое опухолевое поражение или над ним.

Визуализируйте язык с помощью двухфотонной микроскопии с помощью титанового сапфирового лазера с интенсивностью 60 милливатт и длиной входной волны 755 нанометров. Чтобы оптимизировать сигнал М-вишни, собирайте последовательные изображения лазерного сканирования размером один микрометр с приращением в один микрометр на общую глубину ткани от 15 до 100 микрометров. С помощью такой конфигурации можно анализировать опухоли глубиной до одного миллиметра.

Используйте сканирование изображения для захвата изображений. Скан-изображение генерирует двухканальный выход шаблонов растрового сканирования для управления зеркалами метрической развертки XY и в то же время захватывает максимум четырехканальный сигнальный сигнал одновременно с фотоумножителей через плату сбора данных. Функция Scan Image собирает изображения стека Z, управляя осью Z объектива, и собирает цейтраферные изображения в одиночном или циклическом режиме.

Сохраните изображения в одном файле TIF с 16-битной глубиной. С помощью программного обеспечения Amira можно визуализировать стеки изображений опухоли в одно трехмерное изображение, открыв файл TIF, содержащий набор изображений стека Zs. Используйте функцию TEX для создания трехмерного рендеринга.

На визуализированном изображении, скорее всего, будет присутствовать большое изображение первичной опухоли с несколькими меньшими диссоциированными инвазивными группами или igs. Чтобы измерить объем опухоли, определите порог площади первичной опухоли и каждый срез стека изображений с коррекцией и устранением фоновой флуоресценции. Повторите процедуру порогового определения для каждой инвазивной группы.

После того, как первичная опухоль и все igs выбраны, определите измерение объема, а также координаты OID опухоли X, Y и Z для первичной опухоли. Чтобы рассчитать расстояния igs от центральной точки опухоли, рассчитайте индекс инвазивности опухоли или ti с использованием ti равен N NT умножить на VT умножить на dt. Где NT равно общему числу ig на изображении, VT равно общему объему всех igs, а DT равно общему расстоянию, пройденному всеми инвазивными группами от центра первичной опухоли.

Трехмерная визуализация с большей топографической детализацией может быть создана путем импорта исходных 16-битных монохромных файлов наконечников в элементы Nikon NIS в программном обеспечении. Создайте файл ND из стека изображений. Затем вручную откалибруйте документ, чтобы указать размер в пикселях для более высокого качества рендеринга.

Добавьте дополнительные ломтики в плоскости Z. На этом рисунке показан пример исходных данных, полученных от двухфотонного изображения элементов NIS или зеркала. Программное обеспечение может быть использовано для реконструкции исходных данных опухолей языка, которые показаны на этом рисунке.

На этой панели показан пример трехмерного рендеринга с использованием функции TEX в программном обеспечении Amira. Ниже приведен пример порогового значения отдельного двухфотонного среза из стека изображений для идентификации инвазивных групп из первичной опухоли, а также из первичного опухолевого центра или оида. После анализа каждого порогового участка Амира количественно оценивает объем и расстояние, пройденное каждой инвазивной группой из Центра.

Эти данные могут быть графически продемонстрированы и использованы для получения числового значения полного уровня инвазии опухолевых клеток. После освоения от точки извлечения языка до окончательной 3D-визуализации, эта техника может быть выполнена примерно за два часа, если она правильно выполнена во время попытки этой процедуры. следите за тем, чтобы не проколоть язык иглой насквозь, тем самым теряя опухолевые клетки и препятствуя приему опухоли после этой процедуры. Тестирование терапевтических соединений или клеток с манипулируемыми уровнями белка может быть проведено для определения их эффективности при инвазии рака полости рта.

В условиях in vivo не забывайте, что работа с опухолевыми клетками человека, модифицированными лентивирусом, является опасной мерой предосторожности, такой как надлежащие СИЗ и работа в сертифицированном BSL двухслойном колпаке при работе с инъекционными мышами.