Перитонеальная изоляция нейтрофилов низкой плотности: метод получения нейтрофилов низкой плотности из жидкости перитонеального лаважа с использованием магнитно-активированной сортировки клеток

Нейтрофилы низкой плотности, или LDN, представляют собой отдельную субпопуляцию нейтрофилов, обнаруженную в повышенном количестве при патологических состояниях, таких как рак желудочно-кишечного тракта. LDN могут быть выделены из полостных полостей или жидкости для промывания брюшины пациентов.

Сначала отфильтруйте жидкость для промывания для удаления остатков тканей. Центрифугируйте фильтрат для получения гранулы, содержащей клетки крови, в том числе LDN. Повторно суспендируйте его в подходящем буфере. Нанесите слой этой суспензии на подходящий градиент плотности, оптимальный для изоляции LDN.

Центрифуга для разделения различных компонентов крови на основе их относительной плотности. Более плотные эритроциты образуют нижний слой, в то время как наименее плотная плазменная фракция образует самый верхний слой. Менее плотные ЛДН занимают промежуточный слой наряду с другими мононуклеарными ячейками.

Переложите промежуточный слой в свежую пробирку, содержащую блокирующий реагент. Компоненты реагента блокируют неспецифические сайты связывания на всех поверхностях клеток, не являющихся мишенями, и повышают специфичность к LDN при последующем мечении.

Добавьте конъюгированные антителами микрогранулы, нацеленные на определенную молекулу клеточной поверхности, сверхэкспрессированную на LDN. Инкубируйте, чтобы комплексы антитела-гранулы связывались со своими молекулами-мишенями на LDN.

Пропустите инкубированную суспензию через колонку, помещенную в магнитное поле. Под магнитным воздействием все LDN-микрошариковые комплексы прилипают к стенке колонки, проходя через нее немеченые клетки.

Удалите столбец. Промойте содержимое с помощью подходящего буфера для элюирования и соберите фракцию, содержащую LDN.

Чтобы получить нейтрофилы, сначала введите 1 литр обычного стерильного физиологического раствора непосредственно перед закрытием раны непосредственно в брюшную полость пациента, который только что перенес абдоминальную операцию из-за злокачественного новообразования желудочно-кишечного тракта, и обширно промывайте брюшную полость в течение не менее 1 минуты. Затем перемешайте физиологический раствор в полости и восстановите 200 миллилитров жидкости для промывания с помощью четырех 50-миллилитровых шприцев.

В лабораторных условиях жидкость для перитонеального лаважа через 100-микрометровый нейлоновый фильтр в отдельные 50-миллилитровые пробирки для центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулы в 5 миллилитрах PBS с добавлением 0,02% ЭДТА и тщательно наложите на каждую клетку суспензию на 3 миллилитров градиентного раствора плотности. После разделения градиента плотности соберите от 2 до 3 миллилитров промежуточного слоя из каждой пробирки и промойте образцы перитонеальной жидкости в 10 миллилитрах свежего PBS плюс EDTA на пробирку. Налейте гранулы в 10 миллилитров свежего PBS плюс EDTA для дополнительной промывки и разбавьте клетки до 1 умножения 10 на 7 клеток на 60 микрометров магнитно-активированной сортировки клеток, или MACS, буферной концентрации.

Блокируйте любое неспецифическое связывание 20 микролитрами Fc-блока в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия с последующим добавлением 20 микролитров анти-CD66b магнитных шариков. Через 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия промойте и повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах буфера MACS и добавьте элементы в магнитный столб соответствующего размера в магнитном поле подходящего магнитного сепаратора. Когда все CD66b-отрицательные ячейки пройдут через колонку, добавьте 15 миллилитров свежего буфера MACS в резервуар колонки и перенесите колонку из магнитного сепаратора в новую коническую трубку. Затем немедленно погрузите колонку, чтобы промыть магнитно маркированный CD66b позитив в трубку.