Жидкофазная изоэлектрическая фокусировка: метод электрофореза для выделения биологически активных молекул из сырого экстракта Gymnema sylvestre

Начинают с предварительно собранной изоэлектрической фокусировки, ИЭФ ячейки – установки жидкофазного электрофореза. Эта колонна представляет собой разделенную горизонтальную пористую камеру с четко выраженными положительными и отрицательными выводами на концах.

Теперь возьмем растительный экстракт, содержащий сложную смесь по-разному заряженных компонентов с различными изоэлектрическими точками, pI - pH, при котором суммарный заряд молекулы равен нулю.

Экстракт дополняют амфолитами переменного заряда, которые в дальнейшем облегчают фракционирование компонентов образца.

Загрузите образец в загрузочные отверстия колонны. В настоящее время столбец ВЭФ имеет постоянный рН. Затем подайте высоковольтное напряжение для начала электрофореза.

Под действием электрического поля растворимые амфолиты мигрируют к противоположно заряженным электродам и создают линейный градиент pH по всей колонке. Компоненты образца начинают мигрировать через градиент pH жидкой фазы, а компоненты, расположенные при pH ниже pI, несут суммарный положительный заряд.

Они мигрируют к отрицательному электроду до тех пор, пока компоненты не достигнут своего pI, где их заряд нейтрализуется, и миграция прекращается. Аналогичным образом, компоненты с pH выше pI мигрируют к положительному электроду и останавливаются, когда достигают pI. Таким образом, компоненты образца разделяются на основе их pI на сфокусированные отсеки. Соберите очищенные фракции для дальнейшего анализа.

Добавьте 0,6 грамма растительного экстракта Gymnema sylvestre в 60 миллилитров дистиллированной воды. Растворите растительный экстракт, перемешивая в роликовой трубке в течение пяти минут.

Чтобы удалить нерастворимые частицы, центрифугируйте раствор при давлении 10 000 x g в течение пяти минут. Переложите надосадочную жидкость в стеклянный стакан объемом 150 миллилитров, и добавьте амфолит для создания 1% раствора по объему, примерно 0,6 миллилитров.

С помощью 50-миллилитрового шприца с 1,5-дюймовой иглой 19-го калибра с тупым концом загрузите раствор в ячейку IEF через отверстия для сбора образцов. Затем снимите элемент с подставки и постучите по электродной камере, чтобы выбить и удалить любые пузырьки.

Подключите устройство к охлаждающей воде. При постоянной мощности 15 Вт начните фракционирование. Запускайте блок IEF до тех пор, пока напряжение не достигнет постоянного значения, примерно три часа.

После нажатия кнопки Harvest ON совместите контакты сборщика фракций с отверстиями сбора. Проденьте штифты через уплотнительную ленту, чтобы начать сбор фракций Gymnema sylvestre.