Анализ ветвления гликогена для измерения степени ветвления гликогена

Разветвленные полисахариды, такие как гликоген, содержат остатки глюкозы, связанные линейно через альфа-1,4-гликозидные связи и в ответвлениях через альфа-1,6-гликозидные связи.

Чтобы определить степень разветвления полисахаридов, начните с водного цветного реактива, содержащего йодид калия, йод и хлорид кальция. В водных условиях йодид калия и йод выделяют ионы йодида.

В отдельных микроцентрифужных пробирках смешать реагент с полисахаридами известных разветвленных структур и образцом гликогена с нехарактерной структурой.

Полисахариды приобретают спиральные структуры через свои альфа-1,4-гликозидные связи. Ионы йодида связываются с этим спиральным ядром, образуя линейные полийодидные цепи. Это приводит к образованию комплекса переноса заряда между полисахаридами и полийодидными цепями, что приводит к образованию окрашенных полисахарид-йодидных комплексов.

Неразветвленные полисахариды с более длинными полийодидными цепями приобретают синий цвет, тогда как разветвленные полисахариды с более короткими полийодидными цепями развивают комплексы от желтоватого до оранжево-коричневого цвета. Хлорид кальция в составе реагента усиливает сложный цвет.

Переложите смесь в одноразовые кюветы. С помощью спектрофотометра измерьте спектр поглощения от 330 до 800 нанометров.

Неразветвленные комплексы с синим цветом поглощают свет на более длинных волнах, демонстрируя сдвиг максимумов поглощения вправо. Напротив, разветвленные комплексы поглощают свет на более коротких волнах, при этом сдвиг максимумов поглощения влево указывает на более высокое разветвление в структуре.

Максимумы поглощения нехарактерного образца гликогена на глубине около 450 нанометров подтверждают его разветвленную структуру.

Чтобы определить разветвление гликогена, смешайте 650 микролитров цветного реагента йода/хлорида кальция со 100 микролитрами воды в пробирке объемом 1,5 миллилитра и тщательно перемешайте раствор перед тем, как переложить его в одноразовый метакрилатный кювет. Поместите кювету в спектрофотометр для проведения прогона в режиме сканирования длины волны для сбора фонового спектра от 330 до 800 нанометров.

В отдельной пробирке объемом 1,5 миллилитра соедините 650 микролитров рабочего цветного реагента йод/хлорид кальция с 50 микрограммами гликогена устрицы, и получите итоговый объем до 750 микролитров с водой. Тщательно перемешав смесь, переложите раствор в одноразовую метакрилатную кювету для сбора спектра поглощения от 330 до 800 нанометров.

Аналогичным образом, получите спектр поглощения с 50 микрограммами амилопектина и 30 микрограммами амилозы, как описано ранее.

Чтобы получить представление о разветвленной структуре нехарактерного образца гликогена, смешайте от 25 до 50 мкг гликогена с 650 микролитрами рабочего красящего реагента на основе йода/хлорида кальция и действуйте, как описано ранее, для получения спектра поглощения.