5-метилцитозиновый дот-блот для определения степени метилирования ДНК

Метилирование ДНК — это эпигенетическая модификация, которая включает в себя добавление метильной группы к цитозиновому основанию ДНК с образованием 5-метилцитозина. Эта модификация изменяет экспрессию генов.

Чтобы количественно оценить метилирование ДНК с помощью дот-блоттинга, возьмите образцы геномной ДНК, полученные из хондроцитов человека на различных стадиях дедифференцировки, которые демонстрируют различные уровни метилированного цитозина.

Обработайте образцы ДНК гидроксидом натрия — сильной щелочью — и нагрейте их. Эта обработка разрывает водородные связи между двумя нитями ДНК, что приводит к денатурации ДНК. Добавьте ацетат аммония для нейтрализации щелочи, предотвращая чрезмерную деградацию ДНК.

Возьмите нейлоновую мембрану и выделите денатурированные образцы ДНК в виде точек. Отрицательно заряженная ДНК связывается с положительно заряженной нейлоновой мембраной посредством электростатических взаимодействий, в результате чего она покрывается промоканием на твердой основе.

Обработайте промокающую мембрану блокирующим буфером, чтобы предотвратить неспецифическое связывание. Далее добавьте в мембрану антитела против 5-метилцитозина, и инкубируйте. Эти антитела связываются исключительно с метилированным цитозином на ДНК.

Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела, и добавьте вторичные антитела, конъюгированные с хемилюминесцентным ферментом, которые специфически связываются с первичными антителами.

Добавьте на мембрану хемилюминесцентную подложку. Фермент на антителе вступает в реакцию с субстратом, образуя хемилюминесценцию, образуя точки различной интенсивности.

Сфотографируйте мембрану и измерьте интенсивность точек, которая соответствует степени метилирования ДНК в каждом образце.

Начните эту процедуру с денатурации выделенной ДНК в 0,1 моляре гидроксида натрия в течение 10 минут при температуре 95 градусов Цельсия. Нейтрализовать ДНК 1 моляром ацетата аммония на льду, а затем разбавить в два раза дважды дистиллированной водой.

Самым важным этапом в точечном блоттинге является нанесение пятен на образцы на мембрану, делайте это медленно и осторожно. Постарайтесь свести к минимуму каждый пятнистый участок до 3-4 миллиметров в диаметре.

С помощью кончика пипетки с узким горлышком аккуратно поместите 2 микролитра серийной разбавленной геномной ДНК на положительно заряженную нейлоновую мембрану в центре сетки. Промокните мембрану при температуре 80 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем блокируют неспецифические сайты связывания антител, замачивая мембрану в 5% BSA в TBST в 10-сантиметровой чашке Петри на 1 час при комнатной температуре с легким встряхиванием.

Через 1 час промойте мембрану трижды в TBST в течение 5 минут каждый раз. Инкубируйте мембрану с мышиным анти-5-метилцитозиновым моноклональным антителом в TBST при 4 градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день промойте мембрану трижды в TBST в течение 5 минут каждый раз.

Затем инкубируют со вторичным антителом — конъюгированным с пероксидазой хрена овечьим антимышиным иммуноглобулином G в TBST в течение одного часа при комнатной температуре. После промывки мембраны в TBST, как и раньше, добавьте ферментный субстрат к мембране, и выдерживайте от 5 до 10 минут. Наконец, визуализируйте сигнал вторичного антитела с помощью хемилюминесцентного набора в соответствии с инструкциями производителя.