JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 5:13 мин • July 8th, 2025
Начните с постнатального коронального отдела мозга мыши, содержащего вентральную область гиппокампа, область в нижней области мозга.
Разрежьте брюшную ткань гиппокампа и перенесите ее в подходящую среду.
Разрежьте салфетку на более мелкие кусочки и прикрепите их к покровному стеклу с матричным покрытием в многолуночной пластине.
Нейроны из ткани начинают расширять проекции.
Затем возьмите прилежащее ядро, полученное из эмбриона мыши, небольшую ткань глубоко внутри переднего мозга.
Разрежьте ткань прилежащего ядра на небольшие кусочки. Переложите их в пробирку.
Добавьте ферменты пищеварения для диссоциации белков внеклеточного матрикса. Умойтесь, чтобы снизить уровень ферментов.
Пипеткой проталкивайте кусочки ткани вверх и вниз, чтобы получить отдельные клетки.
Центрифугируйте клетки. Удалите надосадочную жидкость и снова суспензируйте клетки.
Добавьте эту суспензию в покровный лист с помощью вентральных тканей гиппокампа и инкубируйте.
Нервные окончания из вентрального участка ткани гиппокампа соединяются с нейронными клетками прилежащего ядра, образуя коммуникационный узел, называемый синапсом.
Перед сбором тканей предварительно инкубируйте 12-миллиметровые стеклянные покровные стекла с покрытием из поли-D-лизина в 24-луночных планшетах для культивирования тканей с 500 микролитрами питательных сред при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее 30 минут. Затем удалите носитель перед нанесением покрытия на микросрезы. Чтобы собрать ткань для посева, удалите верхнюю часть черепа, чтобы обнажить весь мозг каждого принесенного в жертву щенка.
Под рассекающим микроскопом, начиная с места, где кора головного мозга отделяется друг от друга каудально, получают корональный срез, содержащий заднюю кору, включая вентральный гиппокамп. Затем рассеките вентральные ткани гиппокампа, содержащие CA1-субикулумные области. После этого перенесите ткани в 35-миллиметровую чашку для культивирования, содержащую холодные питательные среды.
Впоследствии нарезаем ткани далее на небольшие, тонкие ломтики. Нанесите на срезы отполированную огнем пастеровскую пипетку в центре покровного стекла 50 микролитров среды, чтобы облегчить прикрепление эксплантов. Затем нанесите вентральные микросрезы гиппокампа на покровную крышку.
После того, как экспланты осядут на покровную крышку, аккуратно добавьте 100 микролитров дополнительной среды у стены, чтобы уровень среды был достаточно высоким, чтобы полностью покрыть экспланты на периферии, но не те, которые находятся в центре покровного стекла. Затем инкубируйте экспланты в течение ночи при 5%CO2 при 37 градусах Цельсия до дисперсии нейронов прилежащего ядра. Теперь получите ткани прилежащего ядра от эмбрионального 18-го дня до постнатального первого дня у мышей дикого типа.
Нарежьте их небольшими кусочками. Затем переложите их в 15-миллилитровую трубку. Обрабатывайте ткани двумя миллилитрами 0,25% трипсина в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Впоследствии промойте салфетки три раза пятью миллилитрами четырех градусов Цельсия стиральным средством и дайте суспензии отдохнуть в течение пяти минут на каждом этапе стирки.
Затем промойте салфетки в пяти миллилитрах четырех градусов Цельсия питательной средой один раз. Затем диссоциируйте клетки путем легкого растирания в двух миллилитрах питательных сред с помощью слегка отполированной пипеткой Пастера. После этого переложите клеточную суспензию в другую 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте со скоростью 2000 об/мин в течение пяти минут.
Через пять минут удалите надосадочную жидкость, и повторно суспендируйте клетки в питательных средах из расчета один миллилитр на шесть детенышей. Затем диспергируйте клетки, осторожно несколько раз пипетируя среду с помощью отполированной огнем пипетки Пастера. В конце добавьте 0,25 миллилитра дисперсных прилежащих клеток ядра в каждую покровную полосу с вентральными эксплантампами гиппокампа. Поместите планшеты с культуральными культурами на влажные и стерильные марлевые салфетки для механической стабилизации и поддержания влажности с целью облегчения образования синапсов. Затем инкубируйте планшеты при 5%CO2 при 37 градусах Цельсия.