Генерация экспланта ганглия дорсального корешка и диссоциированной клеточной культуры

Начните с ганглия дорсального корешка или тканей DRG в среде, не содержащей сыворотки. Ткань DRG содержит сенсорные нейроны и сателлитные глиальные клетки, встроенные во внеклеточный матрикс, ECM.

Высадите их на чашку для культуры, покрытую смесью студенистого белка для улучшения адгезии к тканям.

Со временем глиальные клетки высвобождают нейротрофические факторы роста, которые позволяют расширять нейроны, создавая культуру эксплантов DRG.

Чтобы получить диссоциированную клеточную культуру, возьмите эти экспланты DRG в пробирке. Лечите их коллагеназой для разрушения ВКМ, а затем трипсином, который нарушает клеточные связи, высвобождая нейроны и глиальные клетки.

Добавьте среду, обогащенную сывороткой, чтобы остановить ферментативную реакцию.

Пипетируйте содержимое несколько раз, чтобы создать одноклеточную суспензию, и отфильтруйте ее, чтобы удалить мусор.

Центрифугируйте эту клеточную суспензию и удалите надосадочную жидкость, содержащую фермент

Ресуспендируйте клетки в нейробазальной среде и перенесите их на пластину, покрытую ламинином.

Сателлитные глиальные клетки и сенсорные нейроны прилипают к пластине, покрытой ламинином, образуя диссоциированную клеточную культуру.

Переложите каждую DRG в сухую стеклянную чашку Петри. Под хирургическим микроскопом очистите и обрежьте лишние волокна и соединительную ткань, все еще прикрепленные к DRG, с помощью лезвия. DRG легко идентифицировать как выпуклую, прозрачную структуру вдоль белого спинномозгового нерва, и часто встречаются кровеносные сосуды, окружающие DRG.

После этого поместите очищенное до DRG вещество в новую чашку Петри, содержащую ледяную среду без сыворотки. Разведите смесь желатиновых белков в ледяной среде, не содержащей сыворотки, в соотношении 1 к 1. Затем поместите DRG ex vivo в 12-луночные планшеты, предварительно покрытые 10 или 20 микролитрами смеси желатиновых белков, и держите их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30-60 минут.

Теперь аккуратно добавьте от 1,5 до 2 миллилитров бессывороточной среды в систему культивирования, чтобы покрыть весь эксплант и поддерживать экспланты в условиях культивирования. Меняйте питательную среду DRG каждые 72 часа. и пусть ДРГ растет столько, сколько нужно.

Это критически важный этап, поскольку DRG крепится к стеклянной пластине с помощью смеси желатиновых белков. Поэтому время полимеризации и навыки пипетирования имеют решающее значение для предотвращения всплытия.

При этой процедуре поместите все собранные DRG в 1,5-миллилитровую стерильную пробирку с F12 средой, содержащей коллагеназу IV, и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение 45 минут. После этого замените свежую среду, содержащую коллагеназу внутривенно, и инкубируйте образец еще 45 минут. Затем обработайте экспланты 2 миллилитрами среды F12, содержащей 0,025% трипсина, при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Сразу после внутривенного введения коллагеназы инкубируйте их с 2 миллилитрами среды F12, содержащей фетальную бычью сыворотку при температуре 37 градусов Цельсия, в течение 15 минут. После этого трижды промойте экспланты 2 миллилитрами среды F12 и приступайте к их механической диссоциации стеклянной пипеткой, пока среда не помутнеет.

После этого отфильтруйте диссоциированную клеточную культуру через фильтр 0,22 микрометра, чтобы удалить любые загрязнения и излишки соединительной ткани. Затем центрифугируйте отфильтрованный лизат клеток в течение двух минут. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 микролитрах нейробазальной среды. Поместите диссоциированные клетки на покрытые ламинином покровные стекла с желаемой плотностью клеток.