Изучение влияния пестицидов на нейроны Caenorhabditis elegans

Начните с агаровой пластины, содержащей трансгенный Caenorhabditis elegans, экспрессирующий зеленые флуоресцентные белки или GFP в своих нейронах.

Добавьте в тарелку стерильную воду, взболтайте ее, чтобы поднять червей, и переложите их в трубку.

Дайте червям осесть, затем удалите лишнюю воду и снова суспензируйте их.

Перенесите ресуспендированных червей в пластину, покрытую пестицидами, и контрольную пластину без пестицида, затем инкубируйте.

Основываясь на их действиях, пестицид специфически повреждает определенные нейроны и вызывает набухание нейронов, снижая экспрессию GFP.

Переложите червей на агарозную подушечку, содержащую обезболивающее средство, затем наложите покровную крышку.

Установите предметное стекло на флуоресцентный микроскоп. Сначала визуализируйте червей в фазово-контрастном режиме, затем переключитесь в режим флуоресценции.

У червей, обработанных пестицидами, нейроны демонстрируют сниженную флуоресценцию, набухшие сомы и пробелы в нейронных процессах, что указывает на нейродегенеративные эффекты.

Во время контроля здоровые нейроны показывают неповрежденную сому с яркой флуоресценцией.

С помощью микропипетки внесите 1 миллилитр стерильной воды на пластину нематоды. Затем прополощите воду вокруг, чтобы поднять нематод. Затем удалите жидкость с нематодами в 1,5-миллилитровую микрофуговую пробирку. Через 10 минут, когда нематоды осядут под действием силы тяжести, осторожно удалите не менее 500 микролитров воды и выбросьте.

Затем снова суспендируйте нематод и с помощью отрезанного желтого наконечника пипетки удалите от 50 до 100 микролитров взвешенных червей на каждую пластину для лечения, убедившись, что на каждой пластине есть не менее 10 взрослых червей. Подготовьте два предметных стекла, поместив кусок этикеточной ленты только с одной стороны предметного стекла, чтобы образовалась прокладка одинаковой толщины.

Затем поместите чистую, неиспользованную горку между ними на столешнице. Нанесите 10-микролитровую каплю расплавленной агарозы на центр предметного стекла с помощью микропипетки. Затем расплющите каплю, поместив сверху еще одно чистое предметное стекло перпендикулярно предметному стеклу с каплей, и надавите, чтобы агарозная капля образовала толщину этикетировочной ленты.

После этого приложите постоянное давление, чтобы разделить два предметных стекла. Затем положите предметное стекло агаровой стороной вверх на столешницу и дайте ему высохнуть в течение одной-двух минут перед использованием. Чтобы добавить нематод на подготовленную горку с агарозной подушечкой, добавьте в агаровую прокладку 5-микролитровую каплю воды, содержащей 1 моляр азида натрия, что обезболит червей и мобилизует их.

Затем перенесите не менее 10 нематод за одно лечебное стекло в каплю с помощью червячной кирки, которую следует простерилизовать до и после переноса нематод. Далее добавьте покровный лист с помощью щипцов, расположив его под углом и медленно опустив.

После этого поместите подготовленное влажное крепление на флуоресцентный микроскоп для наблюдения за червями, сначала при 10-кратном увеличении и фазовом контрасте, затем при 40-кратном увеличении с фазовым контрастом и флуоресцентным освещением.

Поместите по одному подготовленному мокрому креплению на предметный столик микроскопа и закрепите его на месте с помощью зажимов для микроскопа. Затем начните просмотр мокрых креплений с минимальным объективом увеличения, который обычно составляет 10x, и используйте яркое поле или фазовый контраст для визуализации и фокусировки на нематодах.

Как только нематода окажется в поле зрения, сфокусируйтесь на ней с помощью ручки точной фокусировки на микроскопе. Затем переключите подсветку на флуоресцентную, повернув диск, и направьте свет на камеру, чтобы получить цифровые изображения.

Затем отрегулируйте освещенность с помощью программного обеспечения для визуализации таким образом, чтобы нейроны были ярко освещены, но не перенасыщены. В какой-то момент получите отдельное изображение линейки с тем же увеличением, что и изображения клеток, чтобы обеспечить масштаб увеличения для их фигуры.