Визуализация микроглии сетчатки in vivo на мышиной модели глаукомы

Возьмем, к примеру, трансгенную мышь под наркозом и страдающую глаукомой, заболеванием, которое повреждает зрительный нерв и приводит к потере зрения.

Микроглии, резидентные иммунные клетки в сетчатке глаза, экспрессируют помеченный флуорофором белок для визуализации.

Покоящаяся микроглия имеет разветвленную морфологию с разветвленными проекциями. Повреждение нервов, вызванное глаукомой, активирует микроглию, которая принимает амебовидную форму с меньшим количеством выступов.

Поместите мышь на платформу офтальмоскопа и совместите линзу объектива с одним глазом.

Глаза закрываются контактными линзами, чтобы свести к минимуму сухость, а зрачки расширяются для расширения поля изображения.

Визуализируйте сетчатку с помощью инфракрасного излучения, которое уменьшает повреждение тканей.

Определите корешок зрительного нерва, где аксоны ганглиозных клеток сетчатки сходятся, образуя нерв.

Используйте кровеносные сосуды сетчатки в качестве ориентиров для установления фокальной плоскости.

Переключитесь в режим флуоресценции, чтобы получить изображение микроглии, которая выглядит как ярко флуоресцентные пятна, и оценить наличие активированной микроглии, состоящей из увеличенных клеточных тел и сниженной сложности ветвления.

Начните сеанс визуализации со сбора глазного дна внутренней части сетчатки. Для этого выберите инфракрасный режим, который соответствует длине волны возбуждения 820 нанометров. Затем отрегулируйте мощность лазера до 100%, а чувствительность от 40% до 60%.

Затем, работая на высокой скорости, определите местоположение глаза с помощью джойстика, чтобы ориентировать офтальмоскоп, и приготовьтесь к сбору изображения глазного дна зрительного диска и сосудистой сети сетчатки. Осмотрите роговицу и хрусталик на предмет травм или помутнения. Исключите из исследования глаза с дефектами или травмами, которые могут повлиять на получение изображения. Теперь, поднеся объектив ближе к глазу, найдите область диска зрительного нерва, которая является поверхностью диска зрительного нерва, или ONH.

Затем центрируйте изображение на ONH. Правильное расположение ONH является ключом к получению равномерной фокусировки и излучения по всему изображению. Следующим этапом является визуализация внутренних плоскостей сетчатки, а также ОГН. Для референсной фокальной плоскости используйте крупные кровеносные сосуды, расположенные на купоросной поверхности сетчатки, что соответствует 59 и 60 диоптриям, или даже глубже на 55 диоптриях в областях выкопанных дисков зрительного нерва.

Затем отрегулируйте насыщенность изображения с помощью ручки на сенсорной панели, пока белый ореол освещения не покроет большую часть глазного дна вокруг оптического диска. Затем выберите более низкую насыщенность, которая создает равномерный ореол, указывающий на оптимальный контраст для этого глаза. Если темные участки сохраняются, может потребоваться повторная юстировка камеры.

Теперь соберите изображение глазного дна с высоким разрешением, усреднив 30 кадров, сделанных в режиме реального времени, чтобы улучшить соотношение сигнал/шум. Это соответствует нормализованной частоте 4,7 кадра в секунду. Немедленно и в том же положении приготовьтесь к сбору флуоресцентного изображения GFP-положительных клеток. Переключитесь в режим флуоресцентной визуализации на сенсорной панели, которая выбирает синий лазер с лазерным возбуждением 488 нм и набор барьерных фильтров от 460 до 490 нм. И установите сбор данных на 100% мощности лазера и чувствительность от 100 до 125%.

Теперь соберите двумерное флуоресцентное изображение ONH по одной точке XY, в среднем 100-кратное сканирование. Затем сделайте многоточечное изображение сетчатки вокруг ONH. Выберите композит на панели управления, а затем проведите офтальмоскопом по носовой височной оси.

Программное обеспечение автоматически усредняет только что отсканированные области и сшивает их в режиме реального времени. Если качество изображения участков сетчатки недостаточно для усреднения, зеленый круг, обозначающий сканируемую область, станет красным. Полученное составное изображение покрывает площадь до 1,7/4 миллиметра.

Следует соблюдать осторожность при получении составного изображения. Изображения с высоким разрешением могут быть потеряны при слишком быстром перемещении объектива до завершения сканирования, усреднения и сшивки изображений.

Когда анестезия начинает ослабевать, сеанс визуализации должен быть завершен, потому что мышь начинает тяжело дышать, и визуализация становится невыполнимой.