Двухфотонная микроскопия для визуализации морфологии нейронов у детеныша мыши

Начните с настройки источника возбуждения для двухфотонного микроскопа.

Возьмем, к примеру, трансгенного щенка мыши, находящегося под наркозом, с круглым стеклянным окном для визуализации и имплантированной в череп головой.

Нейроны экспрессируют красные флуоресцентные белки для облегчения визуализации.

Очистите стеклянное окно визуализации и закрепите щенка на двухфотонном столике для визуализации.

Совместите окно изображения с объективом микроскопа, отрегулировав голову щенка.

Используйте грелку для поддержания температуры тела щенка.

Отрегулируйте скорость потока анестетика.

Нанесите каплю воды на покровное стекло, затем опустите линзу объектива микроскопа.

Двухфотонная микроскопия использует два фотона света для активации флуоресцентных белков, что позволяет получить детальную визуализацию нейронов с минимальным фоновым шумом и фотообесцвечиванием.

Захват изображений нейронов на разной глубине, чтобы визуализировать их структуру Наконец

, сложите изображения, чтобы создать трехмерное представление нейрона, включая их нейронные проекции, для изучения морфологических изменений, связанных с ростом.

Чтобы начать визуализацию, сначала установите длину волны двухфотонного лазера. Для возбуждения RFP используйте длину волны 1000 нанометров. Протрите поверхность защитного стекла 70% этанолом. Приложите щенка, находящегося под наркозом, к титановой пластине на предметном столике с помощью титанового стержня. С помощью столика угломера отрегулируйте головку так, чтобы защитная крышка была параллельна линзе объектива.

Поддерживайте температуру тела щенка во время визуализации, используя грелку, установленную на 37 градусов Цельсия, и снижайте концентрацию изофлурана до 0,7% до 1%. Поместите предметный столик под объектив с 20-кратным увеличением двухфотонного микроскопа. Нанесите одну каплю воды на покровное стекло.

Настройте программное обеспечение на получение изображений z-стека с интервалом 1,4 микрона. Для визуализации нейронов четвертого слоя установите ширину z в диапазоне от 150 до 300 микрон, чтобы отобразить всю морфологию дендритов. Используйте медленное сканирование и усреднение, чтобы получить четкие изображения, показывающие морфологию нейронов.

Обычно требуется более 20 минут, чтобы получить всю морфологию дендритов.