Сердце Dissection в личинок, несовершеннолетних и взрослых данио рерио, Danio rerio

Общая цель этой процедуры заключается в удалении сердца у рыбок данио. Это достигается путем предварительного сбора и фиксации рыбок зебры. Затем полость тела вскрывается для визуализации сердца.

Затем сердце удаляется и очищается от несердечной ткани. Наконец, сердце фотографируется. В конечном счете, морфологию сердца с течением времени можно увидеть с помощью микроскопии, разреза и фотографии.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение в качестве ключа к вскрытию. Ста трудно освоить, потому что рыбки данио маленькие, а ткани не различаются по цвету, и их может быть трудно идентифицировать. Для этих экспериментов проводят индивидуальные грушевые или групповые случки со взрослыми рыбами.

Очистите эмбрионы и храните их в инкубаторе при температуре 28 градусов Цельсия. Через пять дней после оплодотворения разделите рыб по аквариумам с плотностью от 10 до 15 рыб и поместите их в помещение для рыб. Удалите рыбок из аквариума в соответствующем возрасте и поместите ее в 0,2%Трику для обезболивания.

Поместите обезболенных рыб в ледяную воду на 15 минут для усыпления. Тем временем добавьте в блюдо 4% параформальдегида или PFA в одном XPBS. Инкубируйте собранную рыбу в 4%-ной PFA в течение одного-двух часов при комнатной температуре, затем в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия в чашке Петри, завернутой в перфил.

Это сохраняет рыбу в горизонтальном положении и значительно облегчает вскрытие после фиксации. Дважды промойте в PBS с 0,1% подростком или PBT рыбу можно хранить в PBT при температуре четыре градуса Цельсия до 10 дней. Положите одну рыбу в чашку Петри, наполовину наполненную свежей PBS, и положите ее на правый бок.

Измерьте длину рыбы от рыла до основания хвоста, не считая хвостовых плавников, с помощью цифрового миллиметрового штангенциркуля. Это стандартная длина или sl. Назначьте каждой рыбе комбинацию цифр и букв, чтобы можно было отследить отдельную рыбу и полученное в результате расчлененное сердце для последующего анализа.

Внесите все данные, включая все измерения, в электронную таблицу и систематизируйте на основе этих меток перед вскрытием. Маркируйте полоски для ПЦР-пробирок с присвоенным номером отслеживания и заполняйте пробирки PVT или другим раствором, подходящим для дальнейшего анализа. Ориентируйте брюшной участок рыбы вверх в чашке Петри, стабилизируя тело с помощью щипцов, держа голову между глазами и жабрами для рыб короче 12 миллиметров стандартной длины.

С помощью острых щипцов или микроиглы в держателе булавок. Удалите грудные мышцы и плавники из тела, чтобы открыть сердце. Постоянное движение щипцов во время вскрытия может вызвать течения в ППТ, которые приводят рыбу в движение.

Это особенно проблематично для более мелких рыб. Таким образом, с помощью микроиглы нужно удалить грудные мышцы и плавник и открыть полость тела. С помощью щипцов аккуратно вычерпните сердце из полости из-под предсердия.

Если у рыбы содержится флуоресцентный сердечный маркер, используйте флуоресцентный эндоскоп для вскрытия и проверьте удаление сердца с помощью флуоресценции. После того, как сердце будет извлечено из полости, используйте щипцы для удержания сердца и микроиглу для удаления лишней внесердечной ткани и эпикардиальной оболочки с внешней стороны сердца. Для рыб длиной более 12 миллиметров стандартной длины.

С помощью микроножниц с пружинной ручкой сделайте три надреза. Сначала сделайте поперечный разрез через жабры. Во-вторых, сделайте еще один поперечный разрез на передней части живота.

И в-третьих, сделайте сагиттальный разрез с брюшной стороны, соединив оба поперечных разреза. С помощью острых щипцов удалите грудные мышцы и плавники из тела, чтобы открыть полость тела и обнажить серебристую ткань перикарда. Удалите эту ткань перикарда, и сердце станет видимым.

С помощью микроножниц перережьте артерию, соединенную с бульбусным артериозом, расположенным выше сердца. После того, как эта артерия будет перерезана, поместите кончики щипцов под предсердие и с помощью щипцов вытащите сердце из полости. Если вместе с сердцем поступает лишняя ткань, это нормально, так как позже ее можно удалить.

В качестве альтернативы, у некоторых рыб можно удалить сердце, осторожно вытащив луковицу, и остальная часть сердца последует за ней. Будьте осторожны с расположением предсердия, если используете альтернативную технику, так как его можно легко повредить. Если с сердцем поступает лишняя ткань, это нормально и может быть удалено впоследствии.

После того, как сердце будет извлечено из полости, используйте два щипца, чтобы удержать сердце и удалить лишнюю ткань, или одну пару щипцов для удержания сердца и микроиглу для удаления лишней несердечной ткани. Чтобы сфотографировать сердце рыбки данио, приготовьте чашку Петри из питательного агара весом 23 грамма на литр и накройте застывший агар PBS. С помощью щипцов сделайте в агаре углубление, которое позволит сердцу поместиться в правильной ориентации.

Извлеките сердце из ПЦР-трубки, удерживая кончик бульбуса. Крепко щипцами. Поместите сердце в чашку для агара.

Ориентируем сердце в агаре для фотографирования. Образец можно поворачивать после каждого рисунка во все возможные ориентации. Используйте сверху, свет и короткую выдержку, чтобы сфотографировать сердца.

Внесите поправки на качество света, используя экспозицию, если это необходимо, чтобы получить наилучшую фотографию. Пример хорошо расчлененного чистого сердца показан здесь. Каждое сердце будет иметь некоторые различия в общей морфологии, но сердце должно быть полноценным, содержать неповрежденное предсердие желудочка и луковичный артериоз после его развития.

Этот метод проложил путь для исследователей в области развития сердца у рыбок данио, чтобы изучить созревание сердца на различных стадиях развития рыбок данио.