В естественных условиях Биолюминесценция изображения опухоли Гипоксия Динамика груди метастазы рака мозга у мышей

Биолюминесценция визуализации гипоксии индуцируемый фактор-1α деятельности применяется для контроля внутричерепного развития опухоли гипоксии мозга рака молочной железы мыши модель метастазов.

Общей целью данного эксперимента является неинвазивная оценка динамики гипоксии опухоли при метастазах в мозг при ортотопическом раке молочной железы на мышиной модели. Это достигается за счет стабильной трансдуцирования клеток рака молочной железы MDA MB 2 31 с репортерной конструкцией гипоксии. Затем используются анализы люциферазы in vitro для обеспечения успешной трансфекции и экспрессии репортерной конструкции гипоксии.

Далее проводится биолюминесцентная визуализация in vivo для мониторинга продольных изменений гипоксии опухоли внутричерепных метастазов. Результаты показывают инициацию и эволюцию опухолевой гипоксии метастазов рака молочной железы в мозг на основе биолюминесцентной визуализации паттерна экспрессии репортерного гена гипоксии. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как кислородный электрод EOL, заключается в том, что этот материал является абсолютно неинвазивным и позволяет осуществлять инвазионный мониторинг динамических изменений в продольном направлении.

Применение этого метода распространяется на терапию или диагностику опухолей головного мозга, потому что гипоксия опухоли снижает эффективность традиционной терапии, такой как облучение. Таким образом, определение степени гипоксии опухоли будет полезно при разработке терапевтических вмешательств. Первая культура, клетки люциферазы MDA MB 2 3 3 1 5 H-R-E-O-D-D, которые представляют собой линию клеток метастатического рака молочной железы человека, стабильно трансфицированные новым HIF одним альфа-зависимым геном reporto в дополненной среде DMEM для анализа in vitro HIF один альфа-биолюминесцентный планшет три раза по 10 пяти клеток MDA MB 2 3 1 5 H-R-E-O-D-D люциферазы в каждой лунке двух шестилуночных планшетов, инкубируют клетки в течение ночи в Инкубатор для культур тканей установлен на 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы позволить клеткам прикрепиться к чашке.

На следующий день. Поместите одну из шести луночных тарелок в камеру гипоксии вместе с чашкой, содержащей от 10 до 20 миллилитров стерильной воды, чтобы предотвратить аберрацию ЭВА культур. Вторая пластина остается в инкубаторе для тканевых культур при 21% кислорода и служит контролем нормоксии.

Подсоедините трубку впускного отверстия к газовому баллону, содержащему 0,1% кислорода, 5% углекислого газа и 94,9% азота. Откройте зажимы впускного и смотрового портов и протравьте камеру гипоксии, чтобы достичь концентрации кислорода 0,1%. Отсоедините источник газа и загерметизируйте камеру, закрыв пластиковые хомуты.

Затем поместите камеру в инкубатор для тканевых культур на 24 часа. Через 24 часа выполните биолюминесцентный анализ, сначала отсадите среду из обоих шестилуночных планшетов и быстро промойте клетки дважды ледяным PBS. Затем добавьте один миллилитр, переработанный холодный PBS, содержащий 100 микролитров Люцифера в полученных с помощью люминесценции изображений, используя спектр эногена с помощью штангенизатора с временами экспозиции 1:30, 60 и 180 секунд.

Измерьте интенсивность биолюминесценции в каждой лунке с помощью программного обеспечения для визуализации в реальном времени в день внутричерепной инъекции, соберите клетки люциферазы MDA MB 2 3 1 5 H-R-E-O-D-D при 80% слиянии с помощью трипсина и центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в свежей, средней температуре и проведите подсчет клеток. Разбавьте клеточную суспензию до конечной концентрации от 10 до пяти клеток в объеме четыре микролитра и поместите ресуспендированные клетки на лед после анестезии.

Обнаженные самки мышей в возрасте от четырех до шести недель с 3% льда фтора, смешанного с кислородом. В индукционной камере перенесите животное в носовой конус, вводя 2% изофтора для поддержания анестезии, простерилизуйте кожу головы, протерев раствором бетадина, а затем 70% спиртом. Далее с помощью острого скальпеля выполните разрез по средней линии и обнажите правое полушарие черепа.

Определите точку, которая находится на расстоянии одного миллиметра впереди коронарного шва и на два миллиметра латеральнее сагиттального шва. Используйте высокоскоростное сверло для бурения отверстия диаметром в один миллиметр. На этом этапе наберите четыре микролитра клеточной суспензии в шприц Hamilton объемом 10 микролитров.

Оснащен иглой Гамильтона 32 калибра. Поместите шприц Гамильтона над отверстием в черепе. Осторожно введите кончик иглы на один миллиметр ниже матры URA.

Как только эта глубина будет достигнута, осторожно нажмите на поршень шприца, чтобы ввести клетки непосредственно в нужный коридор. Д келон. После введения клеток подождите около 30 секунд, затем осторожно извлеките иглу.

Заполните отверстие бора костью, закройте кожу головы рассасывающимися швами и простерилизуйте область 70%-ным спиртом. Введите первую инъекцию бупренорфина для обезболивания. Анальгезия бупренорфином вводится каждые 12 часов в течение двух дней.

Убедитесь, что животное полностью восстановилось после приема анестетика. Затем вернитесь в домашнюю клетку. Через две недели после внутричерепной имплантации клеток инициируйте продольную биолюминесценцию с помощью системы спектра ВСУС.

После одновременной анестезии трех мышей 3%изофом, фтором и кислородом. Вводят раствор 120 миллиграмм на килограмм Люцифера в общем объеме 80 микролитров в область затылка. Сразу после введения инъекции установите таймер на пять минут.

Поместите мышей в камеру визуализации и поддерживайте анестезию с 1%изофом, фтором и кислородом со скоростью потока один кубический дециметр в минуту. По прошествии пяти минут с момента люциферианской инъекции. Получение биолюминесцентных изображений с выдержкой 1:30, 60 и 180 секунд.

После получения окончательного изображения извлеките животных из камеры и поместите их обратно в домашнюю клетку, чтобы они могли восстановиться после анестезии. Проанализируйте данные с помощью программного обеспечения для обработки изображений в реальном времени, вручную нарисуйте интересующую область, чтобы очертить сигнал биолюминесценции, а затем используйте абсолютное количество фотонов в секунду для количественной оценки интенсивности сигнала. Повторяйте биолюминесцентную визуализацию один раз в неделю в течение восьми-10 недель.

Затем сразу после последнего сеанса биолюминесцентной визуализации вводят пиол маркер гипоксии и приносят мышей в жертву. Через час после снятия всего мозга встроить в среду оптимальную температуру резки и заморозить морозильную камеру до минус 80 градусов по Цельсию. Последующее гистологическое окрашивание гребня по фиолетовому цвету и иммуногистохимическое окрашивание на фоне люциферазной гипоксии.

Для валидации визуализирующих наблюдений проводится определение маркеров OLE и H one alpha. На этом изображении представлены репрезентативные результаты анализа in vitro HIF на одну альфа-биолюминесценцию. Масштабная линейка справа показывает снизу вверх.

Псевдоизменения цвета связаны с увеличением биолюминесценции. Две верхние лунки клеток MDAM 2 3 1 5 HEDD Lucifer поддерживались в условиях гипоксии. Согласно процедуре, описанной в этой видеостатье, зеленый цвет указывает на повышенную транскрипцию репортера люциферазы из промотора HIF one alpha в ответ на гипоксические состояния.

Две нижние скважины являются контрольными скважинами, которые поддерживаются в условиях нормоксии и испускают только очень низкие уровни биолюминесценции. На этом изображении представлены результаты продольной биолюминесцентной визуализации динамики гипоксии опухоли in vivo. Одно и то же животное визуализировалось один раз в неделю в течение 5-10 недель после внутричерепного введения клеток люциферазы M-D-A-M-B 2 31 5 H-R-E-O-D-D.

Сначала был визуализирован слабый световой сигнал от правой стороны мозга мыши. Через пять недель после внутричерепной имплантации клеток рака молочной железы в течение дополнительных шести недель наблюдался повышенный оптический сигнал, что указывало на усиление гипоксии опухоли. На этом графике показана временная кривая количественного количества фотонов светового сигнала за шесть недель визуализации.

На этом изображении показан 10-микронный срез замороженного мозга мыши, несущий метастазы рака молочной железы: иммуноокрашивание гипоксическим маркером pi Monosol al внутриопухолевая гетерогенность гипоксии здесь очевидна, такая же, как при иммуноокрашивании антилюциферазными антителами. Это наложенное изображение показывает, что внутриопухолевая гетерогенность гипоксии пространственно коррелирует с экспрессией Люцифера. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как применять биолюминесцентную визуализацию для мониторинга динамики гипоксии внутричерепных опухолей на основе их вида гена HRE, о котором сообщается при гипоксии.