Двухслойный сотрудничества культуре первичных Крыса корковых нейронов и глии

Целью этой процедуры является культивирование первичных нейронов в присутствии слоя глии, который поддерживает их рост. Эти нейроны впоследствии могут быть выделены как чистая популяция нейронов для анализа. Это достигается путем культивирования первичных глиальных клеток.

Второй шаг заключается в том, чтобы субкультивировать глиальные клетки на поверхности, которая будет противопоставляться культивируемым нейронам. Затем слои глиальных клеток нейронов объединяются в стабильную систему совместного культивирования. В конечном счете, цитохимический анализ показывает развитие чистого слоя зрелых нейронов.

Здравствуйте, меня зовут Анна Т., и я студентка лаборатории доктора Олимпии Мучи в Университете Дрекселя. Здесь мы покажем, как культивировать нейроны коры головного мозга в присутствии слоя питания глии. Это метод, который был первоначально разработан Гэри Банкером и его коллегами и изучен в лаборатории доктора Мучи и Ричарда Миллера в Чикагском университете, который мы затем адаптировали к нашим экспериментальным потребностям.

Основное преимущество этой методики перед культурой чистых нейронов заключается в том, что трофейные факторы, высвобождаемые глией, поддерживают рост и дифференцировку нейронов. В то время как нейроны впоследствии могут быть выделены как чистая популяция. Чтобы подготовиться к вскрытию, поместите стерильные инструменты в 70% этанол, добавьте четыре миллилитра холодной посуды, средние до 60 миллиметров, затем разморозьте 2,5% трипов и ДНК на льду.

После обезглавливания двух-четырехдневных щенков поместите головы в 100-миллиметровую стерильную посуду для каждой головы. Сделайте промежуточный разрез кожи и оттяните кожу назад, чтобы обнажить череп. Затем с помощью изогнутых ножниц сделайте разрез по средней линии и два боковых разреза через череп, не повреждая мозговую ткань под ним.

После этого удалите верхнюю часть черепа, чтобы обнажить мозг, затем извлеките мозг и поместите его в 60-миллиметровую посуду с четырьмя миллилитрами холодной диссекции, приготовленной предварительно под стереомикроскопом. Отделите полушария, удалите средний мозг и снимите мозговые оболочки. Соберите все рассеченные коры головного мозга в новую 60-миллиметровую посуду со свежей средой для холодной диссекции.

Затем пропустите через мясорубку с помощью изогнутых ножниц. Впоследствии переложите салфетку фарша в стерильную трубку объемом 15 миллилитров. Увеличьте объем до 4,5 миллилитров с помощью медиума для холодной дисперсии и добавьте 500 микролитров 2,5% трип.

Затем оберните тюбик пара-пленкой и поместите его на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 15 минут. Тем временем перемешивайте его, переворачивая трубку каждые пять минут. Затем перенесите ткань в новую 15-миллилитровую трубку и постарайтесь свести к минимуму перенос в трубку среды, содержащей трипсовую среду.

Теперь доведите итоговый объем до 4,8 миллилитров с помощью свежей среды для вскрытия, и добавьте 200 микролитров ДНК до конечной концентрации 60 микрограмм на миллилитр. Затем осторожно разотрите стерильной пятимиллилитровой пипеткой около 20 раз и добавьте 10 миллилитров глио-гальванической среды. Подождите четыре-пять минут, чтобы большие кусочки ткани осядли на дне.

После этого переложите верхние 80% клеточной суспензии в 50-миллилитровую трубку. Затем повторите срок действия ткани с добавлением двух-трех миллилитров покрытия GL. Терпимая. Снова дайте ткани осесть.

После этого перенесите верхние 80% в предыдущую коллекцию. Доведите общий объем до 20 миллилитров. Затем центрифугируйте его в течение 15 минут при 280-кратном G. После этого аспирируйте супинат и повторно суспендируйте клеточную палитру в пяти-семи миллилитрах среды для покрытия ggl.

Затем добавьте дополнительное покрытие, среднее до 10 миллилитров на каждый рассекаемый мозг и хорошо перемешайте клетки. Положите по 10 миллилитров клеточной суспензии в каждую 75-сантиметровую квадратную колбу. После этого инкубируйте культуральную колбу при температуре 37 градусов Цельсия.

Менять питательную среду нужно через 24 – 48 часов, затем каждые три-четыре дня готовить терманские покровные листы. Пластиковая крышка стекла используется для вторичной культуры и добавляет три маленькие капли расплавленного парапластового воска по окружности каждого промытого и автоклавного термадокса. Ячейки будут покрыты с этой стороны термадокса.

Наши термоны представляют собой многоразовые 60-миллиметровые вставки ручной работы с просверленными отверстиями диаметром около 52 миллиметров. Хотя коммерчески доступные вставки для культуральных колодцев также могут использоваться. Следующий шаг – дважды промыть первичный ggl с PBS.

Энергично встряхните каждую колбу, чтобы удалить все неприкрепленные клетки. Каждая колба со сливающейся первичной ggl обеспечит примерно 10 миллионов астроглия. Поэтому мы часто используем от двух до четырех колб в одном эксперименте.

Далее отсоедините ячейки с 0,05% трипов в ЭДТА. Соедините ячейки из двух колб в одну коническую пробирку объемом 50 миллилитров и добавьте равное количество глиссивной среды, затем центрифугируйте в течение 15 минут при 280-кратном давлении. Аспирируйте супинат и растворите гранулы GL в нескольких миллилитрах покрытия GL. Терпимая.

Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и разбавьте клеточную суспензию по мере необходимости. Затем тарелки 500, 000 ячеек либо на 60-миллиметровых тарелках, либо на термопокрытии с использованием гальванической среды GL для термопластины. 600 микролитров клеток на каждой крышке скользят по каплям, а через два часа переворачивают каждый thermadox, чтобы погрузить клетки в среду для глиевых покрытий.

Если вы готовите 60-миллиметровую посуду вторичной глии для прокладок нейронального покрова, смените среду на конец за два вечера до вскрытия нейронов. В эту процедуру, чтобы приготовить 15-миллиметровую стеклянную крышку стекла, добавьте три маленькие капли расплавленного пара-дутья. Нанесите воск по окружности каждого стерильного покровного скольжения, чтобы физически разделить клеточные слои и предотвратить соскабливание клеток.

В крышку вставляются все 60-миллиметровые посуды с 0,5 миллиграмма на миллилитр полилизина на два часа или на ночь. Затем промойте их стерильной водой два-три раза и дайте им полностью высохнуть, чтобы подготовить диссекцию нейронов. Усыпить крысу на 17 день беременности.

Распылите на него 70% этанола и разрежьте кожу посредственно, чтобы обнажить матку. После этого извлеките все плоды и поместите их в стерильную 100-миллиметровую посуду. После быстрого препарирования и обезглавливания каждого плода поместите каждую голову в 60-миллиметровую посуду с четырьмя миллилитрами среды для холодной диссекции под стереомикроскопом.

Используйте пару щипцов, чтобы изолировать кору головного мозга, вскрывая кожу и череп, извлекая мозг, разделяя полушария и удаляя средний мозг и мозговые оболочки. Соберите всю рассеченную кору головного мозга в свежую 60-миллиметровую посуду с холодной средой для рассечения. Затем измельчите ткань изогнутыми ножницами примерно на один миллиметр.

Переложите салфетку для фарша в стерильную трубку объемом 15 миллилитров. Доведите объем до 4,5 миллилитров с помощью холодного диссекционного средства и добавьте в ткани 500 микролитров 2,5%-ного трипса. После этого.

Оберните тюбик пара-пленкой и поместите его на водяную баню при температуре 36 градусов Цельсия на 15 минут. Тем временем перемешивайте его, переворачивая трубку каждые пять минут. Затем перенесите ткань в новую 50-миллилитровую трубку и постарайтесь свести к минимуму попадание в трубку трипсинсодержащей диссекционной среды.

Доведите объем до 4,8 миллилитров с помощью свежей среды для рассечения и добавьте 200 микролитров D Ns до конечной концентрации 60 микрограмм на миллилитр. Затем растирайте примерно 10 раз стерильной пипеткой объемом пять или два миллилитров. При необходимости повторите этот шаг.

С помощью отполированной на огне пипетки для макарон диссоциируйте большую часть ткани, дайте оставшимся кусочкам ткани осесть на дне в течение четырех-пяти минут. После этого удалите верхнюю одноклеточную суспензию, оставив позади осевшие кусочки ткани. Переложите его в новую пробирку с равным объемом нейронной среды и аккуратно перемешайте их.

Затем подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и нанесите их либо на 15-миллиметровые покровные листы, как около 35 000 клеток на 200 микролитров, либо на 60-миллиметровые чашки как около 1 миллиона клеток на три миллилитра. Инкубируйте клетки при температуре 36,5 градусов Цельсия в течение трех-четырех часов после инкубации. Соедините слой нейронов и вторичный ggl для нейронов на 60-миллиметровых тарелках.

Промойте клетки теплым DMEM. Измените среду на четыре миллилитра N две среды и добавьте по одному термону с ggl на каждую пластину. Когда GL обращен к нейронам для пролистывания нейронного покрова, перенесите от трех до пяти покровных прокладок в каждую 60-миллиметровую чашку вторичного ggl с нейронами, обращенными вниз, через 24 часа после покрытия нейронов добавьте 10 микромоляров цитозина Beta D Arab azi в каждую чашку, чтобы предотвратить пролиферацию глии, показанную здесь в качестве примера нейронов из нейроглии путем ламинарного совместного культивирования.

Через пять часов после нанесения покрытия процессы продолжают удлиняться на этом этапе. Вот пример нейронов из кокультуры нейроглии bi lanar через 12 дней после осаждения. На этом этапе хорошо видны расширенные аксоны и ниты клеток.

По мере созревания нейронов дендритные ABA становятся более сложными и развивают синаптические контакты примерно через две-три недели после осаждения. Многие дендритные шипы видны, как показано на этом рисунке. При выполнении данной методики важно работать быстро и для поддержания стерильности каждого реагента при недостатке антибиотиков в нашей культуре.

Среда делает клетки очень восприимчивыми к загрязнению.