В естественных условиях электропорации Morpholinos в Retina взрослых данио рерио
27 декабря 2011 г.
Метод условно нокдаун выражения целевого белка в сетчатку взрослых данио описывается, в котором участвуют intravitreally инъекционных антисмысловых morpholinos и electroporating их на сетчатке. В результате белок сбил в течение нескольких дней, что позволяет тестировать роль белка в регенерирующих или нетронутой сетчатку.
Общая цель данной процедуры заключается в ингибировании или нокдауне экспрессии специфического белка в сетчатке глаза взрослой зебрафиш. Это достигается путем предварительного удаления наружного слоя роговицы глаза рыбы. Затем во внутреннем слое роговицы глаза делается небольшое отверстие.
Затем генспецифичные морфолино вводят в стекловидное тело. В завершение морфолино вводят в клетки сетчатки с помощью электропорации. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие снижение экспрессии целевого белка, используя либо иммунофлуоресцентную микроскопию срезов ткани сетчатки, либо иммуноблоттинг.
Значение данного метода распространяется на терапию дегенеративных заболеваний сетчатки, таких как пигментный ретинит. Благодаря возможности выяснить основные механизмы пролиферации глиальных клеток Мюллера в поврежденной сетчатке, мы можем найти способы индуцировать аналогичный ответ при повреждении сетчатки человека. Хотя данный метод позволяет изучить регенерацию сетчатки взрослой зебрафиш, его можно немного модифицировать для получения информации о других процессах в сетчатке, например, о роли специфических белков в фототрансдукции или зрительном восприятии.
Демонстрация процедуры, разработанной доктором Райаном Таммелом во время его стажировки в качестве постдока. В моей лаборатории будет присутствовать доктор Трэвис Бейли, который в настоящее время работает в моей лаборатории постдоком. Перед работой с рыбами приготовьте положительно заряженные морфолиновые олигонуклеотиды (morphos), меченные лиссамином, которые могут быть электропорированы в клетки, разбавив 300 нмоль Morpho в 100 µL воды, свободной от нуклеаз, до получения раствора с концентрацией 3 мМ.
Для удаления наружного слоя роговицы анестезируйте зебрафиша в возрасте от шести до 12 месяцев в растворе трикайна в концентрации 1 mg/mL или 2% этаноле, разведенном в воде из аквариума. Заверните рыбу в увлажненное бумажное полотенце так, чтобы жабры были закрыты, но глаз оставался открытым. Поместите завернутую рыбу под стереомикроскоп и увеличьте кратность до тех пор, пока диаметр глаза не займет примерно одну треть поля зрения. Затем с помощью пинцета Dumont №5 захватите наружную роговицу рядом с зрительной щелью в области небольшого выступа или края, чтобы предотвратить смещение глаза.
При удалении роговицы зафиксируйте ее другим пинцетом. Затем потяните под малым углом поперек глаза, чтобы извлечь роговицу. Сразу после удаления внешней части роговицы с помощью скальпеля с сапфировым лезвием сделайте небольшой разрез в роговице в месте примыкания зрачка к радужке.
Наберите 0,5 µL раствора morpho в шприц Hamilton, оснащенный сменной тупоконечной иглой 33G. Несколько раз переместите жидкость вверх и вниз, чтобы удалить пузырьки воздуха из системы. Осторожно введите иглу в стекловидное тело через разрез.
Не вводите иглу слишком глубоко, чтобы избежать прокола сетчатки или смещения хрусталика. Медленно введите раствор морфолиновой смеси в стекловидное тело. Бесцветное стекловидное тело будет вытекать из места разреза по мере вытеснения его раствором морфолиновой смеси.
Производите инъекцию до тех пор, пока небольшое количество морфолино не начнет вытекать из разреза. Меченный лиссамином морфолино должен быть отчетливо виден внутри глаза. После инъекции верните рыбу в аквариум для восстановления, используя другой глаз в качестве неинъекционного контроля; установите параметры электропорации: два последовательных импульса длительностью 50 миллисекунд при напряжении 75 вольт.
С интервалом в одну секунду между импульсами после инъекции примерно 10 рыбам. Повторно анестезируйте инъецированную рыбу и оберните её увлажненным кусочком бумаги. Полотенце должно закрывать только жабры, оставляя глаз открытым.
Перенесите рыбу в чашку Петри, наполненную анестетиком. В перчатках аккуратно прижмите рыбу к дну чашки с анестетиком, следя за тем, чтобы глаз был полностью погружен в жидкость. Чтобы воздействовать на дорсальную часть сетчатки, осторожно нажмите положительным электродом вниз на вентральную половину глаза; это приведет к повороту глаза и обнажению дорсальной части глазного яблока. Продолжая нажимать на вентральную сторону, поместите отрицательный электрод на расстоянии от 0,5 до 1 мм от обнаженной дорсальной половины глаза.
Избегайте размещения отрицательного электрода непосредственно на глазу, так как это приведет к повреждению дорсальной сетчатки. Определив подходящее расстояние между электродами, отрегулируйте винт на ручке электродов, чтобы зафиксировать постоянный разнос для последующей электропорации. Проведите электропорацию глаза и верните рыбу в аквариум со свежей водой для восстановления; сразу после этого подвергните рыбу процедуре, вызывающей изменения в экспрессии генов сетчатки, например, ретинальной дегенерации, индуцированной постоянным освещением.
При распиле сетчатки от назальной к темпоральной области по дорсо-вентральной оси синие закрашенные прямоугольники обозначают области сетчатки, которые чаще всего повреждаются в результате самого процесса электропорации. Розовый закрашенный прямоугольник обозначает область, на которую направлено введение морфолино в клетки сетчатки с помощью электропорации. Как показано здесь на изображении справа через три дня после электропорации, метка лиссамина по-прежнему визуализируется во всех слоях и типах клеток в срезе сетчатки, включая наружные сегменты палочек, наружный ядерный слой, внутренний плексиформный слой и ганглионарный слой.
Пустое изображение слева получено из неинъецированного глаза, в котором отсутствует меченый лиссамином морфолино; полный нокдаун белка достигается через три-пять дней после электропорации, в зависимости от эффективности морфолино. В данном примере в сетчатку была введена отрицательная контрольная морфолино или морфолино против PCNA, после чего сетчатки были извлечены после одного, двух или трех дней воздействия света; затем ткань была обработана и иммуноокрашена с помощью антител к PCNA. Во всех трех контрольных сетчатках наблюдалось множество PCNA-положительных клеток (зеленый цвет), однако экспрессия PCNA была значительно снижена в сетчатках, обработанных морфолино.
После освоения данной методики вы сможете проводить процедуру примерно 20 рыбам за один час. При выполнении данной процедуры важно помнить, что после её завершения нельзя прикасаться электродами непосредственно к глазу рыбы. Для получения ответов на дополнительные вопросы, например, о том, какие генетические пути необходимы для регенерации сетчатки, могут быть использованы другие методы, такие как иммуногистохимия, гибридизация in situ, ПЦР в реальном времени и иммуноблоттинг.
Обзор
В данной статье описывается метод условного нокдауна экспрессии целевого белка в сетчатке взрослой зебрафиш с использованием антисмысловых морфолино. Методика включает интравитреальную инъекцию и электропорацию, что позволяет изучать роль белков в регенерации и функционировании сетчатки.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Регенеративная медицина
Теоретические основы
- Понимание функций белков в сетчатке имеет решающее значение для изучения заболеваний сетчатки.
- Рыбки данио-рерио служат модельным организмом благодаря своим регенеративным способностям.
- Методы условного нокдауна позволяют выяснить механизмы восстановления сетчатки.
- Данный метод может иметь значение для разработки методов терапии дегенеративных заболеваний сетчатки.
Цель исследования
- Для ингибирования экспрессии специфического белка в сетчатке рыбки-зебра.
- Для изучения роли белков в регенерации сетчатки.
- Для разработки методики, которая может быть адаптирована для других процессов в сетчатке.
Используемые методы
- Удаление наружного слоя роговицы глаза рыбки-зебра.
- Инъекция ген-специфичных морфолино в стекловидное тело.
- Электропорация морфолино в клетки сетчатки.
- Оценка нокдауна белка с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и иммуноблоттинга.
Основные результаты
- Наблюдалось успешное подавление экспрессии целевого белка.
- Визуализация распределения морфолино в слоях сетчатки.
- Снижение экспрессии PCNA в сетчатках, обработанных морфолино.
- Метод позволяет осуществлять быструю обработку нескольких рыб.
Выводы
- Данный метод представляет собой ценный инструмент для изучения биологии сетчатки.
- Полученные данные могут лечь в основу терапевтических стратегий лечения заболеваний сетчатки.
- Дальнейшие модификации метода могут расширить понимание других функций сетчатки.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Условный нокдаун белков в сетчатке взрослой рыбки-зебрафиш позволяет проводить валидацию мишеней в регенеративной модели, релевантной конкретному заболеванию, что способствует снижению механистических рисков для программ по изучению дегенеративных заболеваний сетчатки. Данный подход обеспечивает прогностическую уверенность в функции белка до этапа идентификации ведущих соединений, особенно для путей, регулирующих активацию глии Мюллера и динамику нейрональных предшественников. Метод соответствует рабочим процессам раннего поиска, требующим функциональной валидации в системе позвоночных с трансляционной преемственностью биологии сетчатки человека.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, обеспечивая временной контроль подавления экспрессии белков на определенных этапах регенерации сетчатки.
- Практическая ценность: способствует уточнению сигнальных путей посредством анализа потери функции в условиях активной регенерации.
- Научная ценность: повышает достоверность выбора мишеней, устанавливая связь между активностью белков и результатами пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующей разработки анализа путем установления воспроизводимой эффективности нокдауна.
- Практическая ценность: Обеспечение возможности количественного считывания данных с помощью иммунофлуоресценции и иммуноблоттинга для поддержки стандартизации анализа.
- Научная ценность: Облегчение подготовки к скринингу за счет возможности оценки роли белков в визуальной трансдукции и обработке сигналов в интактных сетчаточных цепях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает понимание механизмов заболевания за счет моделирования процессов дегенерации сетчатки человека в парадигме регенерации позвоночных.
- Практическая ценность: способствует согласованию трансляционных биомаркеров путем корреляции эффектов нокдауна с динамикой PCNA+ предшественников.
- Научная ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продвижении исследований с учетом рисков путем снижения неопределенности в отношении мишеней, участвующих в глии-опосредованном восстановлении.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в непрерывный процесс разработки — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, что позволяет провести функциональную оценку кандидатов в контексте регенерации сетчатки перед началом доклинических инвестиций.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей за счет возможности стадиеспецифического нокдауна белков в процессе регенерации.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа благодаря стандартизированной электропорации и визуализации распределения морфолино с меткой лиссамина.
- Аналитика: позволяет получать количественные показатели с помощью иммунофлуоресценции и иммуноблоттинга для сравнения эффективности нокдауна при различных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями путем установления связи между фенотипами нокдауна и механизмами восстановления сетчатки, актуальными для человека.
- Повторное использование в масштабе предприятия: служит многократно используемой платформой для изучения различных мишеней на разных стадиях регенерации и в различных процессах в сетчатке.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности валидации мишеней посредством условного временного нокдауна в регенеративной модели.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость за счет определенных параметров электропорации и визуализации с помощью лиссамина.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о целесообразности дальнейших разработок (go/no-go) за счет снижения механистической неопределенности в путях восстановления сетчатки.
- Влияние на портфель: Приоритизация мишеней с поправкой на риск на основе функциональной валидации в системе, релевантной для данного заболевания.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с Danio rerio, навыки микрохирургии и методов электропорации.
- Зависимость от специализированного оборудования, включая электродные пинцеты и программируемые генераторы импульсов.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения единообразия подготовки и доставки морфолино.
- Требуется учет особенностей адаптации при распространении метода на другие ретинальные процессы, такие как фототрансдукция.
- Практические ограничения включают риск повреждения тканей при неправильном расположении электродов и вариабельность длительности нокдауна в зависимости от эффективности морфолино.
