Выделение и расширения человеческих клеток глиобластомы мозга Опухоль Использование Neurosphere Пробирной

Целью данного протокола является изоляция и экспансия клеток мультиформной глиобластомы человека с использованием метода нейросфер. Это достигается путем первоначального измельчения полученной ткани опухоли, последующей механической диссоциации и, наконец, высева полученных клеток для выращивания в культуре нейросфер. В этом видео мы продемонстрируем, как изолировать и экспансировать стволоподобные клетки из ткани глиобластомы человека, используя метод культуры нейросфер.

Этот метод также может быть использован для культивирования клеток других опухолей головного мозга, а также солидных опухолей, таких как опухоли молочной железы, предстательной железы, печени и легких. Итак, приступим. После получения иссеченного образца ткани ГБМ в результате хирургического вмешательства среду удаляют.

Опухоль промывают два или три раза стерильным PBS для удаления загрязняющих веществ, таких как кровь и клеточный детрит. После промывки резецированную опухоль помещают в стерильную чашку Петри. Сначала разрежьте опухоль на более мелкие части, затем перенесите порцию опухолевой ткани в отдельную чашку Петри и измельчите ткань на очень мелкие фрагменты с помощью скальпеля № 10.

Это увеличит площадь поверхности, доступную для ферментативной диссоциации. Измельчение может занять от одной до трех минут в зависимости от размера опухоли. Теперь добавьте от 3 до 5 мл предварительно нагретого трипсина к измельченной ткани и перенесите ее в стерильную пробирку Falcon объемом 15 мл.

Поместите пробирку объемом 15 Ml в водяную баню при 37 °C на 10–15 минут. Встряхивайте пробирку каждые пять минут. Для обеспечения лучшего переваривания ткани добавьте равный объем ингибитора трипсина, чтобы остановить реакцию.

Активацию трипсина обеспечивают путем многократного пипетирования смеси. Центрифугируйте суспензию при 800 RRP M или 110 G в течение пяти минут. Удалите супернатант, затем ресуспендируйте осадок в 1 ml базовой среды для нейральных стволовых клеток, прижав наконечник к дну пробирки.

Произведите пипетирование вверх и вниз от трех до семи раз, чтобы разбить комки до получения однородной млечной суспензии; избыточное пипетирование может привести к гибели клеток. Установите фильтр 40 мкм на пробирку объемом 50 мл. Добавьте от 10 до 15 мл базальной среды в суспензию клеток и аккуратно перемешайте, затем пропустите суспензию клеток через фильтр 40 мкм для удаления клеточного дебриса и нерастворившихся комков.

Промойте клетки в PBS и удалите супернатант с помощью вакуумного аспиратора. Ресуспендируйте клетки в 1–2 мл полной среды. Затем осторожно перемешайте суспензию с помощью пипетирования для достижения гомогенности.

Смешайте 10 µL клеточной суспензии с 90 µL трипанового синего. Тщательно перемешайте суспензию и перенесите 10 µL в гемоцитометр. Выполните подсчет клеток, как показано здесь.

Для точного подсчета клеток необходима суспензия из одиночных клеток без образования агрегатов. Клетки, окрашенные трипановым синим, учитывать не следует. Используйте этот подсчет при посеве клеток в T 80 флакон.

Добавьте 20 ml полной среды для нейральных стволовых клеток в пробирку объемом 50 ml. Добавьте соответствующий объем клеточной суспензии, чтобы достичь плотности 200 000 клеток на ml. Затем добавьте EGF до конечной концентрации 20 nanogram per ml.

Добавьте 0,2% гепарина в концентрации 1 µl на ml. В конце добавьте BFGF до достижения конечной концентрации 10 ng/ml. Перемешайте клетки в полной среде, дополненной факторами роста.

Затем перенесите суспензию в пронумерованный флакон Т80. Поместите флакон в инкубатор при 37 °C и 5% CO2 на 7–10 дней. Через восемь дней культивирования сферы полностью вырастают и становятся готовыми к пассажированию.

Соберите содержимое колбы и перенесите его в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте клетки при 800 RPM в течение пяти минут. Удалите супернатант с помощью вакуума, затем ресуспендируйте осадок в 1 мл предварительно нагретого трипсина.

Инкубируйте клетки на водяной бане при 37 °C в течение двух минут. Добавьте равный объем ингибитора трипсина и тщательно перемешайте для обеспечения активации. Затем осадите клетки центрифугированием.

Удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в 1 мл полной среды, осторожно перемешивая содержимое пипеткой до гомогенизации клеточной суспензии. Проведите подсчет клеток, как описано ранее, чтобы высеять их в колбу T 80 с 20 мл полной среды в пробирке объемом 50 мл. Добавьте необходимое количество клеточной суспензии для достижения плотности 50,000 клеток на мл.

Теперь добавьте факторы роста, включая E-G-F и B-F-G-F, а также гепарин в концентрации, указанной ранее. Осторожно перемешайте полученную суспензию клеток, затем перенесите её в флакон T 80 и поместите в инкубатор на период от 7 до 10 дней. Перед вами пример первичной культуры GBM.

Через четыре дня на этом этапе можно заметить, что клетки пролиферируют и начинают образовывать сферы. На данной стадии не должно наблюдаться крупных сферических клеточных кластеров; их появление свидетельствовало бы о неправильной подготовке ткани.

После пребывания в культуре от семи до 10 дней формируются сферы различного размера; когда сферы достигают среднего диаметра от 150 до 200 микрон, они готовы к пассажированию. Это пример пассажа культуры GBM через восемь дней. Снова видны сферы разных размеров; здоровые сферы имеют микровыросты по периферии.

Подготовка суспензии из отдельных клеток является крайне важным этапом при культивировании сфероидов. В противном случае даже на следующий день после посева клеток можно наблюдать клеточные агрегаты. Такие агрегаты могут быть приняты за сфероиды, однако следует отметить, что для формирования истинных сфероидов из посевных клеток требуется не менее одной недели.

Количество клеточного дебриса в первичной культуре опухолевых сфер варьируется в зависимости от многих факторов, таких как источник ткани, точность забора ткани, а также метод ее обработки. Надеемся, что данное видео будет вам полезно, и желаем удачи в ваших экспериментах.