Выделение и расширения человеческих клеток глиобластомы мозга Опухоль Использование Neurosphere Пробирной

Целью данного протокола является выделение и экспансия мультиформных опухолевых клеток глиобластомы человека с использованием актива нейросферы. Это достигается путем предварительного измельчения собранной опухолевой ткани, последующей механической диссоциации и, наконец, пластикирования полученных клеток для выращивания в культуре нейросферы. В этом видео мы покажем, как выделять и расширять стволовые клетки из ткани опухоли глиобластомы человека с помощью метода культивирования нейросферы.

Этот метод также может быть использован для культивирования клеток из других опухолей головного мозга, а также солидных опухолей, таких как молочная железа, простата, печень и легкие. Итак, приступим. После получения резецированной ткани опухоли GBM в результате хирургического вмешательства, среда удаляется.

Опухоль промывают два или три раза с использованием стерильного PBS для удаления загрязнений, таких как кровь и мусор. После промывания поместите резецированную опухоль в стерильную чашку Петри. Сначала разрежьте опухоль на более мелкие порции, затем перенесите часть опухолевой ткани в отдельную чашку Петри, измельчите ткань с помощью скальпеля номер 10 на мельчайшие кусочки.

Это увеличит площадь поверхности, доступную для ферментативной диссоциации. Измельчение может занять от одной до трех минут в зависимости от размера опухоли. Теперь добавьте в салфетку для фарша три-пять мл подогретого трипсина и переложите его в стерильную пробирку для сокола объемом 15 мл.

Поместите тюбик объемом 15 мл на водяную баню при температуре 37 градусов на 10-15 минут. Встряхивайте тюбик каждые пять минут. Чтобы обеспечить лучшее переваривание тканей, добавьте равный объем ингибитора трипсина, чтобы остановить реакцию.

Трипсин при активации страхуется путем пипетирования вверх и вниз несколько раз. Центрифугируйте суспензию при 800 РРЦ М или 110 G в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте поддон в одном мл базальной среды нейрос-стволовых клеток, прижав кончик к дну пробирки.

Пипетируйте вверх и вниз от трех до семи раз, чтобы разбить комки, пока не получите молочную суспензию, пипетирование может привести к гибели клеток. Поместите фильтр 40 микрон на пробирку объемом 50 мл. Теперь добавьте от 10 до 15 мл базальной среды к клеточной суспензии и аккуратно перемешайте, пропустите клеточную суспензию через фильтр 40 микрон, чтобы удалить мусор в несвязанных комочках.

Поставьте клетки и вакуумируйте надземные. Ресуспендируйте клетки в одном-двух мл полной среды. Затем аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы гомогенизировать суспензию.

Смешайте 10 микролитров клеточной суспензии с 90 микролитрами трианового синего. Хорошо перемешайте суспензию и переложите 10 микролитров в гемо. Цитометр. Выполните подсчет ячеек, как показано ниже.

Для точного подсчета клеток требуется суспензия с одной клеткой без комков. Не включайте в состав триан синие положительные клетки. При подсчете пластинчатые ячейки помещают в колбу Т 80

Добавьте 20 мл полной среды нейростволовых клеток в пробирку объемом 50 мл. Добавьте соответствующее количество клеточной суспензии для достижения плотности 200 000 клеток на мл. Теперь добавьте EGF, чтобы достичь конечной концентрации 20 нанограмм на мл.

Добавьте 0,2%-ный гепарин в концентрации один микролитр на мл. Наконец, добавьте BFGF, чтобы достичь конечной концентрации 10 нанограмм на мл. Смешайте клетки в полноценных средах с добавлением факторов роста.

Ну тогда перенесите подвеску на метку Т 80. Затем колбу переносят в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение 7-10 дней. После восьми дней культивирования сферы полностью выросли и готовы к прохождению.

Соберите содержимое колбы и переложите в две центрифуги объемом 50 мл. Ячейки на 800 об/мин в течение пяти минут. Пропылесосьте супернат, затем снова суспендируйте поддон в одном мл предварительно разогретого трипсина.

Инкубируйте клетки на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух минут. Добавьте равное количество ингибитора трипсина и тщательно перемешайте, чтобы обеспечить активацию. Затем гранулируйте ячейки.

Удалите супернат и повторно суспендируйте клетки в одном мл полной среды, осторожно пипетируйте вверх и вниз, чтобы гомогенизировать клеточную суспензию. Проведите подсчет клеток, как описано выше, чтобы поместить клетки в колбу с температурой Т80 в количестве 20 мл полной среды в пробирке объемом 50 мл. Добавьте соответствующее количество клеточной суспензии для достижения плотности 50 000 клеток на мл.

Теперь добавьте факторы роста, включая E-G-F-B-F-G-F, и гепарин в концентрации, описанной ранее. Полученную клеточную суспензию осторожно перемешайте, затем перелейте суспензию в T 80 и поместите в инкубатор на семь-10 дней. Вот пример первичной культуры GBM.

Через четыре дня на этой стадии вы можете видеть, как клетки разрастаются и начинают формировать сферы. На этом этапе не следует наблюдать большие сферические скопления клеток. Это могло произойти в результате неправильной подготовки тканей.

После пребывания в культуре от 7 до 10 дней формируются сферы различного размера, когда они достигают среднего диаметра от 150 до 200 микрон, они готовы к прохождению. Это пример пассажа культуры GBM через восемь дней. Опять же, вы можете видеть сферы разных размеров, здоровые сферы, демонстрируют микрошипы на их периферии.

Приготовление одноклеточной суспензии является очень важным вопросом в любой сфере культуры В противном случае вы можете наблюдать агрегаты ячеек даже на следующий день после нанесения покрытий на ячеек. Эти агрегаты можно принять за сферы, но следует отметить, что для формирования истинных сфер перфорированным ячейкам требуется не менее недели.

Количество мусора в первичной культуре опухолевой сферы варьируется в зависимости от многих факторов, таких как источник ткани и то, насколько точно ткань была удалена, а также техника обработки ткани. Надеемся, это видео будет вам полезно и удачи в ваших экспериментах.