Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать надежный протокол для получения жизнеспособных гепатоцитов в больших количествах. Это достигается путем перфузии раствора коллагеназы через воротную вену крысы. Затем диссоциированные клетки изолируют и очищают с помощью сетчатого нейлонового фильтра, а мертвые клетки отделяют от жизнеспособных клеток с помощью раствора для каждого звонка.

Заключительным этапом является культивирование гепатоцитов в инкубаторе. В конечном счете, этот протокол генерирует до 100 миллионов клеток на один препарат с 90% жизнеспособностью клеток. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что эта процедура требует хирургических и специальных культурных шагов, которые можно лучше понять с помощью видео, чем текста, демонстрирующего процедуру технику из моей лаборатории.

Буфер следует прогреть в течение 30 минут на водяной бане при температуре 42 градуса Цельсия. Это соответствует оптимальной температуре на выходе из канюли в 37 градусов по Цельсию. Перфузионная система состоит из автоклавируемого насоса, эластичной трубки и водяной бани, на которой задан расход перистальтического перфузионного насоса до 10 миллилитров в минуту.

Далее обезболить взрослую крысу с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина и ксилазина. Когда крыса больше не реагирует на болевой щилок, сбрейте волосы на животе и очистите операционную область бетадином и этанолом. Введите через разрез по средней линии и обнажите воротную вену печени.

Осторожно переместите внутренние органы вправо наружу брюшной полости и вставьте ангиокатеризацию 18 калибра в воротную вену печени. Подсоедините трубку PERFUSE eight к игле и начните инфузию в C two с низкой скоростью потока с предварительным подогревом перфузионного буфера 1. При правильном выполнении печень должна мгновенно начать бледнеть.

Как только будет подтверждена успешная канюляция, разрежьте нижнюю полую вену CVA, чтобы дать возможность провести flx. Еще одним испытанием для успешной канюляции является легкое давление на НПВ. С помощью тампона все доли печени должны быстро начать набухать.

Далее увеличиваем расход буфера до 25 миллилитров в минуту. Печень должна стать бледного цвета. Как только печень побледнеет, переключите перфузионный раствор на буфер два с коллагеназой два на шесть минут пищеварения, от пяти до 10 раз во время пищеварения, надавите на НПВ тампоном в течение пяти секунд.

Печень будет набухать, что приведет к усиленной диссоциации печеночных клеток. В свою очередь, сокращая общее время сбраживания и увеличивая конечный выход. После перфузии коллагеназы печень должна начать выглядеть мягкой.

Препарируйте печень свободно. Поместите его в предварительно охлажденный стерильный стакан с 40 миллилитрами среды и перенесите его в колпак для тканевых клеточных культур для выделения клеток в колпаке для клеточных культур. Переложите печень в чашку Петри с 20 миллилитрами полной среды Вильямса и используйте скребок для клеток, чтобы мягко диспергировать клетки печени, чтобы удалить соединительные ткани и непереваренные фрагменты тканей.

Отфильтруйте клеточную дисперсию через сетчатый фильтр размером поры 100 микрон в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Далее суспензируйте клетки в 40 миллилитрах средней центрифуги. Суспензия при 50 перегрузках в течение трех минут при четырех градусах Цельсия.

Отсасывайте суп, натите и мягко ресуспендируйте клетки. В 40 миллилитрах холодной среды промыть клетки, центрифугировать клетки, снова отсадить снат и аккуратно ресуспендировать клетки. С помощью 25 миллилитров средних гранул клетки и аспирируют мертвые клетки С вершины перол-градиента жизнеспособные клетки остаются внизу.

Суспензируйте жизнеспособную клеточную гранулу в 30 миллилитрах теплой среды и повторите центрифугирование. Повторно суспендируйте гранулу в 20 миллилитрах среды. Подсчитайте клетки внутри суспензии с помощью гемоцитометра и определите жизнеспособность клеток.

Используя окрашивание триановым синим, разведите гепатоциты в Warm Williams, заполните среду до предпочтительной концентрации и нанесите их на непокрытые культуральные планшеты в желаемом объеме. Типичный препарат имеет более 85% жизнеспособных клеток или плотность слияния пластинчатых клеток от 60 до 70%. Это позволяет осуществлять клеточный контакт между клетками, сохраняя при этом достаточное пространство для роста гепатоцитов до их полного размера и получения конечного слияния от 90 до 95% для роста равномерного монослоя гепатоцитов без клеточных агрегатов.

В центральной части лунки дайте пластинам оставаться при комнатной температуре в течение 30 минут до начала инкубации. Иногда, когда вы видите клетки, собирающиеся в центральной области кита, это можно преодолеть, оставив пластину в культурном колпаке на 30 минут, прежде чем отправиться в инкубатор. Это гарантирует, что клетки будут расти в своем ровном монослое.

После четырех часов инкубации среда может быть заменена средой, не содержащей сыворотки, для поддержания морфологии клеток без побочных эффектов со стороны гормонов, что позволяет клеткам восстанавливаться и расти, по крайней мере, в течение ночи перед экспериментом. Критически важные ферменты, такие как P 4 50, будут продолжать функционировать в течение 24 часов, но не намного дольше. При необходимости заменяйте питательную среду через день.

После четырех часов в культуре гепатоциты агрегируют и кластеризуют большинство изолированных клеток, сплющивают и распространяются в типичном монослоевом росте. К 24 часам клетки распространяются в типичном для них монослоевом росте. Их края очерчены, стыки линейны, поверхности достаточно гладкие, видны капли липидов.

Клетки имеют от одного до трех ядрышек, которые имеют круглую форму, расположенные в центре клеток, и ядра демонстрируют одинаковый размер среди клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получить жизнеспособное гепато в больших количествах красным цветом.