Агарозном геле для разделения фрагментов ДНК

Основная цель данной процедуры — разделение фрагментов ДНК различного размера. Для этого сначала подготавливают гель с соответствующей концентрацией агарозы и флуоресцентным красителем. На втором этапе гель заливают в подходящую форму и оставляют до полного застывания.

Образцы наносятся на гель, затем подается ток. Заключительным этапом является визуализация разделенных фрагментов ДНК под ультрафиолетовым светом. Таким образом, гель-электрофорез в агарозе применяется во всех случаях, когда требуется рутинное разделение фрагментов ДНК.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существовавшими на тот момент способами, такими как центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, является возможность визуализации полос ДНК, а также определение точного размера фрагмента ДНК при одновременном разделении с маркером ДНК. Этот метод незаменим в биомедицинских исследованиях, например, при клонировании генов, очистке и секвенировании молекул ДНК. Хотя данный метод обычно используется для разделения фрагментов ДНК размером от 100 bp до 25 kb, он может быть модифицирован для разделения фрагментов ДНК размером до 10 Mb.

Гели из агарозы готовят, используя массово-объемную процентную концентрацию раствора. Концентрация агарозы в геле зависит от размера разделяемых фрагментов ДНК. Чтобы приступить к приготовлению геля, отвесьте необходимое количество агарозы в коническую колбу Эрленмейера и добавьте в колбу соответствующий объем рабочего буфера.

Объем буфера не должен превышать одной трети емкости колбы. Встряхните колбу для перемешивания, затем расплавьте смесь буфера с агарозой, нагревая ее в микроволновой печи на максимальной мощности. Через каждые 30 секунд извлекайте колбу и осторожно перемешивайте содержимое круговыми движениями. Повторяйте процедуру до полного растворения агарозы.

Затем добавьте бромид атериума до концентрации 0.5 µg/mL. Важно отметить, что бромид атериума является канцерогеном, поэтому при работе с гелями, содержащими бромид атериума, необходимо всегда использовать перчатки. Дайте агарозе остыть, поместив ее в водяную баню при температуре 65 °C. В противном случае при остывании агарозы лоток для геля деформируется.

Подготовьте форму для геля, поместив кассету для геля в устройство для отливки. В качестве альтернативы можно заклеить открытые края кассеты скотчем для создания формы. Установите подходящий гребень в форму для геля для создания лунок.

Залейте форму и кольца в форму для геля. Оставьте кольца застывать при комнатной температуре. После застывания колец извлеките гребень.

Если гель не будет использоваться сразу, оберните его пищевой пленкой и храните при температуре four degrees Celsius до использования. Если гель будет использоваться сразу, поместите его в кювету для электрофореза. Чтобы начать процедуру, добавьте краситель для нанесения образцов в образцы DNA, которые необходимо разделить.

Красящий раствор для нанесения обычно готовится в шестикратной концентрации. После установки источника питания на нужное напряжение добавьте в камеру для электрофореза достаточное количество рабочего буфера, чтобы покрыть поверхность геля. Важно использовать тот же рабочий буфер, который применялся при подготовке геля. Подсоедините электроды камеры к источнику питания и включите его. Убедитесь, что камера и источник питания работают исправно.

Появление пузырьков на электродах указывает на прохождение тока. Поскольку руки человека склонны к естественному leichtму дрожанию, может быть трудно поместить кончик узкого дозатора в небольшую лунку. Один из способов уменьшить дрожание руки — опереть её на другую руку или на коробку с гелем.

Медленно и осторожно снимите крышку контейнера с гелем. Внесите образцы ДНК в лунки геля. Краситель для нанесения, содержащийся в пробе, позволяет образцу погрузиться в гель и помогает отслеживать расстояние, которое прошла проба. Вместе с экспериментальными образцами всегда следует наносить маркер размеров ДНК.

Закройте крышку. Еще раз проверьте, что электроды подключены к соответствующим разъемам источника питания. Включите питание и проводите электрофорез геля до тех пор, пока краситель не переместится на необходимое расстояние.

По завершении электрофореза выключите источник питания и снимите крышку камеры для геля. Извлеките гель из камеры и слейте избыток буфера с его поверхности. Поместите кювету с гелем на бумажные полотенца, чтобы удалить остатки рабочего буфера.

Для визуализации фрагментов ДНК извлеките гель из формы и подвергните его воздействию ультрафиолетового излучения. Обычно это выполняется с помощью системы документирования гелей. Полосы ДНК должны проявиться в виде оранжевых флуоресцентных полос.

В конце эксперимента сделайте снимок геля, затем утилизируйте гель и электрофоретический буфер в соответствии с правилами вашего учреждения. На данном рисунке представлен типичный результат агарозного гель-электрофореза продуктов ПЦР. После разделения полученные фрагменты ДНК видны в виде четко выраженных полос.

Разделение стандарта ДНК (маркера длин) должно быть достаточным для точного определения размеров полос образцов. В данном примере фрагменты ДНК размером 765 п.н., 880 п.н. и 1022 п.н. разделены в 1,5% AROS-геле с использованием двухлогарифмического маркера ДНК. При выполнении процедуры важно не забыть дважды проверить правильность размещения электродов перед подачей тока.

Это необходимо для того, чтобы молекулы ДНК перемещались в нужном направлении. После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как подготовить агарозный гель, разделить ДНК на фрагменты соответствующего размера и получить репрезентативные изображения результатов. Не забывайте, что работа с бромистым этидием может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток, защитных очков и лабораторных халатов.