Неинвазивная визуализация диссеминированный кандидоз в Личинки данио рерио

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать методы заражения личинок рыбок данио с использованием грибкового патогена Candida albicans. Сначала готовят флуоресцентную грибковую культуру и покрывают эмбрионы рыб. Далее рыбу выкладывают на тарелку для инъекций.

Candida albicans вводится через ухо каждой рыбы в задний мозг в желудочек рыбака, затем встраивается в аэрос с низким расплавлением и визуализируется с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. В конечном счете, этот метод может быть использован для неинвазивной визуализации взаимодействия патогена хозяина в сложной среде хозяина, а не в упрощенной системе чашки Петри. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как инъекция в вену, заключается в том, что вы создаете локализованную инфекцию, которая приводит к смертельному диссеминированному заболеванию.

Кроме того, этот метод позволяет эффективно вводить большие по своей природе большие клетки C. bucan в маленькую личинку данио-рерио. Начните с того, что нанесите бульон кандида альбикан на дрожжевую палочку. Пластина с агаром декстрозы инкубируется в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию, чтобы дать возможность расти колониям.

Как только колонии станут видимыми, используйте стерильный деревянный дюбель, чтобы выбрать изолированную колонию и растворите дрожжи в пяти миллилитрах свежего дрожжевого бульона Pepto dextrose в пробирках для культуры размером 16 на 150 миллиметров. Поместите культуру на барабан с тканевыми культурами, оснащенный колесом для пробирок и инкубаторами, на ночь при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день перелейте один миллилитр культуры в пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте ее при температуре 14 000 G в течение одной минуты, чтобы гранулировать клетки, затем выбросьте супинат и закрутите гранулу, чтобы ослабить ее.

Повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре вихря PBS и снова центрифугируйте их. Затем выбросьте супинат и повторите эту стирку. Выполните три шага, чтобы удалить остатки питательной среды.

После того, как клетки были промыты, подсчитайте их в гемоцитометре в разведении от одного до 100 в PBS. Для 12-часового посева следует ожидать от трех до четырех умножить на 10-8 клеток на миллилитр. Риз изит дрожжи в конечной концентрации 10 до семи клеток на миллилитр.

Используйте сито для сбора эмбрионов рыбок данио из нерестового аквариума за день до инъекции и храните их в растворе яичной воды, содержащем 60 миллиграммов на миллилитр растворов раствора океанических солей быстрого приготовления в стерильной деионизированной воде. Затем поместите эмбрионы при температуре 33 градуса SIU на 24 часа с 12-часовым циклом светлой темноты. Это позволяет эмбриону развиться до личиночной стадии prim 25, оптимальной стадии для заражения в день заражения.

Перенесите эмбрионы с помощью передаточной пипетки в 60 миллилитрах яичной воды в очень глубокую чашку Петри. Затем пользователь препарирует микроскоп и пинцет Дюмона, чтобы определить покрытие эмбрионов. Этого можно добиться, аккуратно раздвигая кориан, как пакет с картофельными чипсами, пока рыба не выскочит.

После того, как все эмбрионы были очищены. Так что пока в чашке Петри нужно двигать рыбу к центру, переложите рыбу на крышку посуды, удалите среду и замените ее свежей яичной водой. Добавьте рыбу в свежую яичную воду.

Приготовьте 200 мкг на миллилитр раствора трика метансульфоната для обезболивания рыб с помощью передаточной пипетки. Соберите от 20 до 50 эмбрионов и замените их в обезболивающем растворе на одну-две минуты или до тех пор, пока они не перестанут двигаться. Тем временем включите узел впрыска, убедившись, что давление переключается на импульс, а длительность импульса установлена на девять с тремя фунтами на квадратный дюйм для блока обратного давления.

Постепенно открывайте клапан на баллоне с азотом, пока давление впрыска не достигнет 30 фунтов на квадратный дюйм. Затем загрузите в пул микропипетку с пятью микролитрами раствора vortex candida albican и поместите его в держатель микропипетки. Поместите очень глубокую чашку Петри с водой на предметный столик для препарирования микроскопа и отрегулируйте положение микропипеток так, чтобы она оказалась в поле зрения, а ее кончик был лишь частично погружен в воду.

Затем с помощью пинцета обрежьте иглу объединенной пипетки примерно в трех миллиметрах от кончика. Если игла была успешно зажата, нажатие на ножной переключатель инъекционного блока должно позволить дозировать жидкость. С помощью градуированного предметного стекла измерьте выдаваемый объем, затем отрегулируйте давление так, чтобы объем выдаваемой жидкости составлял 0,21 миллиметра в диаметре или чуть меньше зрачка эмбриона рыбки данио.

После того, как микроскоп будет установлен и рыба будет обезболена, набухните чашку, чтобы привлечь рыбу к центру, и возьмите ее в переводную пипетку. Осторожно постучите по боковой стороне пипетки, чтобы рыба осела на кончике. Затем, используя как можно меньший объем, аккуратно переложите рыбу на чашку для инъекций личинок, предварительно разогретую до 28 градусов Цельсия.

С помощью гладкого стеклянного стержня аккуратно выровняйте рыбу вверх. Затем бумажным полотенцем удалите из посуды как можно больше жидкости. Поместите чашку с рыбой под микроскоп до тех пор, пока игла и первая рыба не окажутся в поле зрения.

Убедитесь, что каждая рыба еще жива, наблюдая за наличием видимого сердцебиения. Если он мертв, выбросьте его и переходите к следующему. Переместите стеклянную иглу в сторону рыбы, увеличивая масштаб.

При этом осторожно введите иглу в ухо рыбы круговой структуры с двумя ушными камнями, расположенными сразу за глазом. Как только игла будет на месте, введите дрожжи с помощью ножного переключателя. Если игла введена правильно, то задний мозговой желудочек рыбки немного повернется после укола, втянет иглу и повторит процедуру со следующей рыбой.

Весь процесс должен занимать не дольше 15 или 20 минут, иначе рыба высохнет и погибнет по истечении этого времени. Дрожжи также оседают на дне микропипетки и приводят к неравномерному инфицированию, дозам и/или засорению объединенной микропипетки. После того, как все рыбы будут введены, используйте яичную воду, чтобы смыть их с арос и поместить в свежую чашку Петри, содержащую 60 миллилитров яичной воды.

Затем поставьте блюдо при температуре 28 градусов по Цельсию. Закройте азотный клапан, установите переключатель впрыска в режим непрерывного для сброса давления в трубопроводе бака. Затем, когда давление упадет до нуля, установите переключатель обратно в импульсное положение и выключите узел впрыска

Начните с обезболивания инфицированных рыб в трика метан-сульфате, как описано ранее. После того, как рыба будет обезболена, с помощью пипетки переложите по одной рыбе в чашку Петри, содержащую агар с низким содержанием талого агара 0,4%. Затем с помощью передаточной пипетки перенесите как можно меньше агроса.

Переложите каждую рыбу из чашки Петри в одну лунку стеклянной донной чашки для визуализации в объеме примерно 0,2 миллилитра и 0,4% Низкий уровень таяния с добавлением 200 микрограммов на миллилитр анестетика сверху рыбы так, чтобы внутренние круги заполнились, а тонкий слой ароса распределился по дну лунки. Теперь рыбу можно визуализировать в течение 24 часов с помощью инвертированного микроскопа с лазерной сканирующей конфокальной системой. Через пять часов после заражения рыбок данио красными флуоресцентными кандидами альбиканов.

Дрожжи видны в заднем мозге рыбы у FL I у одной рыбы EGFP, например, сосудистый эндотелий и макрофагальные клетки по всему телу рыбы флуоресцентны. Они показаны здесь зеленым цветом, через пять часов после заражения. Дрожжи можно увидеть в макрофагальных клетках через 24 часа.

Инфекция распространилась по ткани дорсального хвоста, где дрожжи снова могут быть обнаружены в клетках FTIC. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как вводить микроинъекции Candida albicans в задний желудочек мозга данио-рерио Prim 25 стадии, включая одну подготовку грибковой культуры, две обезболивающие личинки данио-рерио. Три микроинъекции в задний желудочек мозга.

И в-четвертых, подготовка инфицированных личинок к конфокальной визуализации.