Замедленной флуоресценции от роста корней арабидопсиса с быстрой манипуляции Корень окружающей среды Использование RootChip

Эта статья предусматривает протокол для выращивания рассады в Arabidopsis RootChip, микрофлюидных платформы визуализации, которая сочетает в себе автоматизированного контроля условий роста микроскопических мониторинга корня и FRET-измерительные внутриклеточных метаболитов.

Для того, чтобы обеспечить максимальную урожайность, растения должны быть обеспечены набором питательных веществ, дефицит питательных веществ, стрессы, такие как холод или сильная жара, засуха или патогенные микроорганизмы, вызывающие огромные потери урожая каждый год. Истоки многих из этих проблем часто лежат под землей. Корень является физическим якорем растения, но он также является органом, отвечающим за поглощение воды и за усвоение минеральных питательных веществ, таких как азот, сульфат фосфора и многие микроэлементы.

Если мы хотим разработать устойчивые подходы к получению высоких урожаев, нам нужно лучше понять, как развиваются корни, как они поглощают этот широкий спектр питательных веществ и как взаимодействуют с симбиотическими и патогенными организмами. Для этого нам нужно иметь возможность исследовать корни на микроскопическом уровне по понятным причинам. Изучение биологии корней всегда было более сложным, чем изучение надземной части растения.

Поскольку корни обычно скрыты под землей, они нелегко доступны для микроскопических исследований. Изъятие из почвы наносит серьезный ущерб корневой системе и, таким образом, не является хорошим способом изучения их поведения. Одним из решений для того, чтобы сделать корни более доступными, является их выращивание на джиде или показано в этом примере в гидропонной среде.

Планы выращивания в желеобразных средах или в гидропонных средах были очень успешно использованы во многих исследованиях корней, но с помощью этих методов все еще очень трудно изучать корни в микроскопических деталях и в течение длительных периодов времени максимально приблизиться к растущему корню и избежать любого физического стресса от подготовки к визуализации. Мы создаем платформу, которая позволяет нам выращивать и визуализировать корни, и в то же время позволяет нам контролировать и изменять микроокружение корней с очень высокой точностью и скоростью. Эту платформу мы назвали корневым чипом. Корневой чип представляет собой микрофлюидное устройство, изготовленное из PDMS, органического полимера на основе силикона.

Чип оснащен камерами наблюдения для роста и визуализации корней из рассады кролика опсиса. Семена сначала прорастают в пластиковых конусах, изготовленных из пластиковых наконечников для пипеток, которые мы заполняем твердой средой. Затем кончик корня прорастает через среду и достигает камеры, где он испытывает непрерывный поток жидкой среды, поддерживая условия в камере.

Микромеханические клапаны Constant, разработанные лабораторией Стива Куэйка в Стэнфордском университете, показаны красным цветом управления. Поскольку чип установлен на прозрачном покровном стекле, как это обычно используется в микроскопии, все процессы в камере наблюдения можно контролировать с помощью инвертированного микроскопа. Раздвоенная структура канала, которая направляет поток жидкости, может быть видна под микроскопом.

Корневая микросхема состоит из двух слоев: контрольного слоя, содержащего клапаны, и проточного слоя, содержащего каналы, по которым тестовые растворы для питательных сред поступают в камеры наблюдения. Объем этих камер составляет примерно 400 нанолитров. Это означает, что требуется очень небольшое количество раствора, и условия могут быть изменены очень быстро.

В этом протоколе описывается, как живые корни восьми сеянцев или саженцев Arabidopsis подготавливаются для параллельной микроскопической визуализации на корневом чипе и наблюдаются в течение трех дней, начиная с заполнения 10-миллиметровой чашки Петри питательной средой, содержащей 1%-агара, пока среда еще жидкая. Наполните 10 микролитров наконечников пипетки пятью микролитрами среды из чашки Петри с помощью многоканальной пипетки. Заполненные наконечники хранятся в коробке с наконечником для дозатора до тех пор, пока среда не станет твердой.

Затем разрежьте на четыре миллиметра пластиковые конусы и поместите вертикально в чашку Петри, содержащую твердую питательную среду. После поверхностной стерилизации отдельные семена помещаются поверх шишек, заполненных средой. Затем чашку запечатывают микропористой лентой и хранят тарелку при четырех градусах для синхронизации прорастания.

Через три дня пластины переносят в шкаф для выращивания для начала прорастания. Наши условия роста в этом эксперименте – 23 градуса. При 16-часовом ярком, восьмичасовом цикле темноты между пятью и семью днями после прорастания, рассада должна быть готова к переносу в корневую стружку на здоровую длину корня, и, если применимо, экспрессию флуоресцентного маркера следует проверить под рассекающим микроскопом.

Как только кончики корней саженцев достигнут нижнего выхода пластикового конуса, отдельные саженцы помечаются для переноса на чип. 10 или около того саженцев растений следует выбрать на случай, если один из них будет поврежден во время переноса, чтобы стерилизовать корневую стружку. Для длительных экспериментов прибор оборачивают тканью, помещают в стеклянную чашку Петри и автоклав.

Этот чип раньше был автоклавом. В эксперименте после охлаждения чип обкладывают жидкой питательной средой. Стружка должна быть полностью покрыта, но уровень жидкости не должен быть выше трех миллиметров над поверхностью стружки.

Пипетка объемом 20 микролитров используется для прокачки среды через входное отверстие Root и выходное отверстие камеры. Это заполняет камеру наблюдения. С помощью выбранной среды пластиковые конусы теперь вставлены в корневую микросхему.

Конус должен плотно прилегать к входным отверстиям. Поскольку корневая микросхема установлена на тонком слое оптического стекла, необходимо быть осторожным, чтобы не оказывать слишком большого давления на микросхему. На этом этапе чип подготавливается к ночной инкубации в жидкой среде, чтобы предотвратить ее всплытие.

На чип помещаются два предметных стекла, одно из которых разрезано пополам. Добавляется магнитная мешалка и блюдо закрывается. Теперь сборка переносится на магнитную мешалку, которая будет мягко перемешивать среду, способствуя росту корней в направлении выпускных отверстий.

Чип корня. Входные отверстия пробиваются под углом для дальнейшей поддержки роста в нужном направлении. Слегка наклоните сборку, приподняв сторону чипа, которая находится напротив выходных отверстий.

Микросхема подсвечивается кольцевой лампой, подключенной к таймерному выключателю для поддержания светлого темнового ритма. После ночной инкубации жидкая питательная среда готовится в герметичном сжимающемся флаконе. Следующие действия следует выполнять быстро и без перерыва, чтобы не допустить пересыхания рассады.

Теперь чип извлекается из жидкой среды и помещается вверх ногами в нижнее отверстие держателя чипа, которое также перевернуто. Чип должен быть ориентирован таким образом, чтобы сторона, содержащая входные отверстия управляющего слоя, была обращена к стороне напорной линии. Два больших разъема в боковой стенке несущей.

Покровное стекло на нижней части чипа высушивается путем аккуратного промокания папиросной бумагой и прикрепляется к носителю. При использовании ленты вся сборка затем переворачивается. Соединители трубок заполняются водой с помощью шприца, и каждый соединитель трубки вставляется в соответствующее входное отверстие.

На чипе. Трубки вставляются в среду и раствор. Затем флаконы и воздух удаляются из трубопроводов путем надавливания на раствор желчи с помощью шприца воздуха, носитель накрывается прозрачным пластиком.

Для поддержания высокой влажности в сборке носитель помещается на предметный столик микроскопа. Он должен точно вписываться в вырезы сцены. Клапаны стружки, а также поток среды через стружку регулируются давлением воздуха.

Две линии с регуляторами ответвляются от основного напорного трубопровода. Один из них используется для управления потоком жидкости, а другой подключается к электромагнитным воздушным клапанам. Эти клапаны управляются от компьютера через USB-контроллер клапанов и отвечают за приведение в действие клапанов на чипе.

Оба регулятора давления должны быть закрыты перед подключением чипа. Трубки, соединители и флаконы с раствором теперь прикреплены к соответствующим напорным трубопроводам. В резервуары носителя добавляют несколько миллилитров воды.

Этот шаг может потребоваться повторить в ходе более длительных экспериментов. Чтобы поддерживать высокую влажность, поддерживайте объемную нагрузку, чтобы свести к минимуму потенциальное количество жидкости, которая может попасть на микроскоп. Кольцевой индикатор перемещается на место над чипом, чтобы поддерживать световой темновой цикл до начала эксперимента.

Клапаны на чипе закрываются путем приложения давления, в данном случае путем открытия электромагнитных воздушных клапанов. Интерфейс лабораторного обзора позволяет управлять клапанами нажатием кнопки под номером клапана. Ярко-зеленый цвет указывает на подачу давления и закрытие клапана стружки.

Эта схема иллюстрирует организацию клапанной системы, в то время как клапаны с четвертого по восьмой действуют как одинарные клапаны с нулевым по трехактный клапаны. В группах с этой системой отдельная камера может быть решена путем активации комбинации клапанов, например, направлять поток жидкости исключительно в третью камеру из верхних клапанов ноль, три и четыре должны быть закрыты. Кроме того, шестой, седьмой и восьмой клапаны управляют, какой раствор используется для промывки входных отверстий A, B и C, теперь активируют все три впускных клапана раствора для их закрытия.

Интерфейс контроллера имеет контур обратной связи, который позволяет контролировать состояние системы. Эту функцию можно активировать, нажав на кнопку обратного чтения. Регулятор давления для управляющего слоя сначала открыт и установлен на 15 фунтов на квадратный дюйм.

Затем регулятор для слоя потока открывается и устанавливается на пять фунтов на квадратный дюйм. Впускной клапан для выбранной по выбору питательной среды открывается и камеры промываются с помощью среды, пути потока должны быть проверены под микроскопом. В большинстве случаев воздух задерживается в каналах и должен быть удален.

Кроме того, каналы управляющего воздуха все еще содержат воздух, который должен быть вытеснен и заменен водой из соединителей трубок. Этот процесс называется тупиковым заполнением. Обе задачи достигаются путем промывки каждой из восьми камер несколько раз до тех пор, пока весь воздух не будет вытеснен из каналов в PDMS.

Система может быть запрограммирована на автоматизацию экспериментов. Такие процедуры также могут быть использованы для дегазации чипа. Основная цель корневого чипа — объединить платформу визуализации и систему размножения в одном устройстве.

Чтобы продемонстрировать манипуляцию с микроокружением корней, мы промыли камеры красителем и измерили обмен жидкости внутри камер. При рекомендуемом давлении в пять фунтов на квадратный дюйм мы измерили полный обмен в течение 10 секунд при расчетной скорости потока примерно 1,5 микролитра в минуту. Мы также наблюдали рост корней рассады, в данном случае выращенной в темноте и снабженной 10 миллимолярной глюкозой в качестве внешнего источника энергии.

В зависимости от условий произрастания, таких как освещенность и состав среды, растения могут наблюдаться в корневом чипе до трех дней. Эта система использовалась для мониторинга внутриклеточных уровней глюкозы и галактозы в корнях, экспрессирующих генетически кодируемые наносенсоры. Эти датчики, основанные на первом или резонансном переносе энергии или ладах, были разработаны в лаборатории Фромера.

Для этого эксперимента корни в чипе были перфузированы квадратными импульсами раствора глюкозы или галактозы. Внутриклеточные уровни сахаров контролировались и представлены здесь, выраженные в виде отношения интенсивности акцепторного фтор-4 цитрина к интенсивности донорского ECFP слева. Мы наблюдаем количество сенсоров цитрин в среднем или метрическом изображении кончика корня, а справа мы отслеживаем количество сахара в ответ на три повторяющихся квадратных импульса глюкозы зеленым цветом и галактозой, показанной красным цветом.

Повышение коэффициента свидетельствует о накоплении сахара. Основными преимуществами корневого чипа по сравнению с традиционными методами роста являются минимально инвазивная подготовка к микроскопии, способность обратимо и многократно изменять среду корня и возможность непрерывного наблюдения за развивающимися и физиологически здоровыми тканями в течение нескольких дней. Еще одним действительно важным преимуществом является то, что требуется лишь минимальное количество жидкости, чтобы со временем снабжать корни всеми необходимыми питательными веществами.

Это делает чип корня очень экономичным, особенно при применении дорогостоящих реагентов. Мы продолжаем оптимизировать корневой чип и повышать его удобство использования, потому что считаем, что, сделав этот важный орган более доступным для лечения и наблюдения, микрофлюидные инструменты, такие как корневой чип, потенциально откроют новые горизонты исследований растений. Более подробную информацию о том, как построить систему корневых чипов, можно найти на нашем сайте.

Чипсы можно заказать в Стэнфордском литейном заводе.