Выделение и культура Индивидуальные мышечных волокон и их сателлитные клетки от взрослых скелетных мышц

Общая цель этой процедуры заключается в выделении и культивировании отдельных живых волокон и связанных с ними стволовых клеток из EDL-мышцы взрослых мышей. Это достигается путем предварительного рассечения EDL с помощью процедуры рассечения сухожилия к сухожилию, которая не повреждает волокна. Затем выполняется переваривание мышц для расчленения волокон с сохранением ассоциации стволовых клеток миофибры, что является уникальным шагом к этому протоколу.

На заключительном этапе отдельные миоволокна аккуратно отделяются друг от друга, в то время как мусор или гиперсжатые волокна удаляются с помощью последовательных промывок. В конечном счете, миоволокна, выделенные с помощью этой методики, могут быть либо сохранены в полуспокойном состоянии с минимальными активационными стимулами, либо культивированы в среде с высоким содержанием сыворотки для изучения активации и дифференцировки клеток-сателлитов. В последние годы использование культивируемых волокон болота стало очень мощным подходом к изучению активации, пролиферации и дифференцировки клеток-сателлитов в соответствующей физиологической нише.

Этот подход действительно позволил нам значительно продвинуться вперед в понимании функции этих клеток на молекулярном и клеточном уровне. Для каждой мыши, от которой выделены EDL, приготовьте пять пластиковых 60-миллиметровых чашек Петри с помощью пипетки лошадиной сыворотки, четыре миллиметра лошадиной сыворотки на чашку и взболтайте ее для равномерного покрытия. Затем удалите из лошадиной сыворотки все остатки сыворотки и дайте блюду высохнуть не менее 30 минут.

Через полчаса добавьте четыре миллилитра моющего средства на четыре тарелки. Обозначьте посуду следующим образом: мышцы после переваривания, вымойте одну, вымойте две и вымойте три. Добавьте четыре миллилитра волокнистой питательной среды в оставшуюся чашку для культуры клетчатки.

Перед использованием держите посуду при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% углекислым газом. Далее для выделения одного волокна подготовьте две стерильные пипетки под микроскопом. Сделайте пипетку с большим отверстием, разрезав пипетку с маленьким отверстием алмазной ручкой так, чтобы отверстие было достаточно большим для промывания всей мышцы.

Вторая пипетка представляет собой пипетку с небольшим отверстием для манипуляций с MyFi. Теперь обжарьте пипетки, чтобы сгладить края и стерилизовать с помощью кривой пламени, кончик пипетки малого диаметра. Это поможет работать с отдельными волокнами во время изоляции.

Затем обмажьте обе пипетки лошадиной сывороткой. Наконец, обязательно очистите станцию микроскопа и инструменты для препарирования 70% этанолом. Для этой демонстрации были отобраны восьминедельные трансгенные мыши SV 1 29.

Были усыплены. Опрыскайте задние конечности 70% этанолом. Затем прижмите животное к опорной доске лицевой стороной вверх.

Это необходимо для обеспечения лучшего захвата задних конечностей. Далее разрежьте конечность по всей длине и обнажите нижележащую мышцу. Удалите кожу, а также любые волосы или шерсть.

С помощью тонких ножниц разрежьте тонкую фасцию, которая окружает мышцу, не повреждая подлежащие ткани. Обнажите дистальные сухожилия TA и EDL с помощью острого коган-вана. Пружинные ножницы.

Разрежьте дистальные сухожилия EDL и TA. Затем с помощью щипцов возьмите мышцы TA и EDL за сухожилия и осторожно подтяните мышцы вверх к проксимальному концу. На этом этапе вы должны быть в состоянии ясно видеть мышцу EDL прямо под мышцей TA.

Теперь отделите EDL от мышцы TA, потянув два сухожилия в противоположных направлениях. Избегайте растяжения мышцы EDL во время выполнения этой операции. Так как это приведет к повреждению миоволокон.

Обнажите сухожилие EDL. На этом этапе может помочь удаление мышцы ТА для лучшей визуализации проксимального сухожилия. Также может помочь отсечение части соединительной ткани вокруг колена.

Как только сухожилие станет хорошо видно, используйте острые ножницы Cohan Venus Spring, чтобы освободить мышцу EDL. Если процедура была проведена правильно, если ЭДЛ должна быть в состоянии сохранять свою удлиненную форму, после удаления из конечности, удерживая мышцу ЭДЛ через ее сухожилия, перенести ее в предварительно теплый двухмиллилитровый раствор коллагеназы, и инкубировать на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Повторите процесс, чтобы выделить вторую EDL и перенести ее в ту же пробирку с коллагеназой до неравномерного переваривания.

Изоляция второго EDL должна быть завершена в течение пяти минут после изоляции. Время первой инкубации EDL может быть скорректировано в зависимости от активности коллагена, размера мышц, возраста животного или состояния мышц. Например, мышцам с большим количеством фиброзной ткани может потребоваться более длительное время инкубации.

Кроме того, обратите внимание, что возбуждение в это время активирует S-клетки во время пищеварения, регулярно проверяйте мышцы, чтобы избежать переваривания. Остановите пищеварение, когда мышцы начнут расслабляться и миоволокна станут видимыми. С помощью пипетки с большим отверстием осторожно перенесите обе мышцы в предварительно разогретую чашку Петри.

При употреблении четырех миллилитров моющего средства следует избегать чрезмерного пищеварения, так как это приводит к гиперсжатию миоволокон. Чтобы высвободить миоволокна, используйте пипетку для стекла с большим отверстием, чтобы промыть мышцу теплой средой до тех пор, пока волокна не начнут высвобождаться естественным образом. Не тритируйте мышцы, так как это неизбежно приведет к повреждению волокон.

Продолжайте отпускать миоволокна до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое количество. Не оставляйте блюдо при комнатной температуре более чем на 10 минут. Верните его в инкубатор на пять минут, чтобы восстановить равновесие, прежде чем работать с ним дальше.

В настоящее время культура содержит смесь живых одиночных миоволокон, которые представляют собой длинные и блестящие трубчатые структуры, гиперсжатые волокна, которые бывают темными и короткими, и мусор. Теперь с помощью пипетки с маленьким отверстием перенесите живые одиночные волокна MYOP в новую предварительно дегельминтизированную чашку. Обрабатывайте каждое волокно myop отдельно.

Вместо того, чтобы переносить основную массу миоволокон сразу, при необходимости верните чашку в инкубатор на 10-15 минут, чтобы восстановить баланс среды. Перенесите одно Myop волокна еще дважды, чтобы удалить все мертвые myo волокна и мусор к концу как минимум трех последовательных стирок. В чашке должны оставаться только отдельные живые миоволокна для культивирования или последующего анализа.

Живые волокна имеют длинную морфологию. Напротив, гиперсжатые волокна короче и толще. Теперь инкубируйте изолированные миоволокна в промывочной среде не менее часа, прежде чем переходить на питательную среду.

В новой предварительно прогретой чашке высокая среда позволит активировать сателлитные клетки для длинных культур. Матригель может быть уместен независимо от выбранного носителя. Меняйте его через день во время изоляции.

Сателлитные клетки на каждом MyFi выглядят как крошечные выпуклости на поверхности миоволокна при наблюдении под световым микроскопом. Если миоволокна сохраняются в среде, богатой сывороткой, в течение длительных периодов времени, в культуре преимущественно наблюдаются полностью дифференцированные миопробирки. Репортерные линии мышей, такие как MIFF five Cree Rosa YFP, являются оптимальными инструментами для изучения процесса регенерации мышц.

Пробирки Myo, полученные из культуры волокна Miff five Cree Rosa YFP, экспрессировали репортер MIFF 5 YFP. Это говорит о том, что для регенерации мышц требуется активация Miff 5. Сорт томатной мыши PAX seven Cree TD — еще одна линейка репортеров.

Сигнал флуоресценции томатов TD обнаруживается только сателлитными клетками, в то время как ядра myON явно отрицательны. Это говорит о том, что фактор транскрипции PAX 7 однозначно экспрессируется мышечными стволовыми клетками, а не их дифференцированным потомством. Миоволокна и связанные с ними сателлитные ячейки могут быть зафиксированы для последующего потока.

Иммунофлуоресцентные PAC семь положительных myo D-положительных сателлитных клеток классически считаются пролиферативными коммичными мышечными предшественниками. Они либо завершат программу дифференцировки путем понижения экспрессии PAC 7 при сохранении экспрессии OD, либо вернутся к спокойствию путем понижения моей OD и поддержания экспрессии PAC 7. Метод выделения одного волокна имеет уникальную особенность сохранения физиологической ассоциации сателлитных клеток миоволокна.

Наиболее важным этапом этой процедуры является рассечение мышцы EDL от сухожилия до сухожилия. Минимальное количество манипуляций с волокнами также позволяет сохранить целостность и жизнеспособность волокна. Успешная изоляция одиночных волокон myop зависит от нескольких факторов, таких как активность коллагена, состояние мышц или возраст.

Самое главное, что изоляция мышцы от сухожилия к сухожилию позволяет сохранить целостность волокон. Кроме того, минимальное количество манипуляций с волокнами на протяжении всей процедуры позволяет повысить выживаемость.