Выделение и Культура неонатологическую мыши кардиомиоцитов

Общая цель этой процедуры заключается в выделении и культивировании кардиомиоцитов новорожденных мышей для использования в последующих анализах. Это достигается путем сначала рассечения сердца неонатальных мышей, а затем ручного разрезания сердечной ткани на мелкие фрагменты. На втором этапе сердечные клетки диссоциируются с помощью серии ферментативных расщеплений. Затем выделенные клетки пластинчат для обогащения кардиомиоцитами. Наконец, можно наблюдать за культивируемыми кардиомиоцитами, прилипшими к пластине и демонстрирующими спонтанное биение. В конечном счете, субклеточная локализация белков в клетках сердечной мышцы, трансфицированных эукариотическими экспрессирующими конструкциями, может наблюдаться с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.

- Основным преимуществом данной методики перед другими методами является робастность и воспроизводимость при выделении и культивировании неонатальных кардиомиоцитов мышей.

- Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сердечно-сосудистых исследований и дать представление об уникальной молекулярной клеточной биологии клеток сердечной мышцы, например, о том, как малые молекулы могут влиять на сердечные сигнальные пути или как биомеханические стимулы могут влиять на локализацию, транскрипцию и экспрессию белков.

- Благодаря универсальной природе получаемых кардиомиоцитарных клеток и культуры, этот метод позволяет использовать множество последующих приложений и эссе, адаптированных к потребностям эксперимента.

- Перед началом выделения сердечной ткани нанесите по 25 миллилитров PBS без кальция и магния, только что дополненных 20 миллимолярами BDM, в каждую из двух стерильных бактериальных мисок, помещенных на лед. Затем добавьте 10 миллилитров изоляционной среды в стерильную 50 миллилитровую коническую трубку, и положите на лед. Теперь быстро стерилизуйте кожу новорожденных мышей в возрасте от одного до трех дней с помощью 75% этанола. После жертвоприношения откройте грудную полость каждого животного вдоль грудины и извлеките каждое сердце с помощью стерильных изогнутых ножниц. Немедленно перенесите сердца в одну из бактериальных чашек, содержащих PBS, с 20 миллимолярными BDM. Затем с помощью щипцов аккуратно выдавите кровь из сердец, а затем переложите вымытые сердечки из первой посуды во вторую. Затем переложите сердца, еще раз, в каплю изолирующей среды объемом 250 микролитров в третью бактериальную посуду. С помощью изогнутых ножниц измельчите сердечки на кубики размером от 0,5 до одного миллиметра, а затем переложите измельченные кусочки в коническую трубку, содержащую 10 миллилитров изоляционной среды. Инкубируйте сердечную ткань с легким перемешиванием при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Перед перевариванием сердечной ткани покройте клеточные культуральные планшеты раствором коллагена в течение как минимум одного часа. Затем удалите раствор коллагена и высушите посуду в стерильном колпаке для клеточных культур с ламинарным потоком. Пока посуда сохнет, подтвердите, что фрагменты тканей агрегированы. Затем дайте осколкам опуститься на дно трубки и удалите все, кроме последнего миллилитра надосадочной жидкости. Добавьте к фрагментам тканей пять миллилитров свежеприготовленной среды для пищеварения, и пять миллилитров среды L-15, дополненной 20 миллимолярным BDM, а затем насытите суспензию кислородом в течение одной минуты. Закройте трубку, а затем перенесите ткань на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. Через две минуты инкубируйте сердечные фрагменты в вибростенде с температурой 37 градусов Цельсия, установленном не более чем на 60 об/мин, в течение 20–30 минут. Затем поместите стерильное клеточное ситечко в стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Предварительно смочите фильтр 5 миллилитрами L-15 с добавлением 20 миллимоляров BDM, а затем используйте предварительно смоченную пипетку для клеточных культур объемом 10 миллилитров, чтобы аккуратно растирать фрагменты ткани от 10 до 20 раз. Дайте более крупным фрагментам ткани отложиться, а затем отфильтруйте надосадочную жидкость, содержащую взвешенные клетки, в трубку. Ресуспендируйте непереваренные фрагменты тканей в пяти миллилитрах среды для пищеварения, а затем инкубируйте фрагменты еще в течение пяти-10 минут при температуре 37 градусов Цельсия с легким перемешиванием. После того, как фрагменты ткани полностью переварятся, осторожно растирайте клеточную кашицу от 10 до 20 раз и процедите раствор через фильтр в коническую трубку, содержащую клетки от первого разложения. Промойте сетчатый фильтр пятью миллилитрами среды, обогащенной L-15, и 20 миллимолярными BDM, а затем уменьшите содержание взвешенных кардиомиоцитов в течение пяти минут при температуре от 50 до 100 G. Удалите надосадочную жидкость, а затем повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах гальванической среды. Затем инкубируйте клетки в 10-сантиметровой чашке для клеточных культур, в инкубаторе для клеточных культур, чтобы удалить любые фибробласты и эндотелиальные клетки. Через один-три часа ресуспендируйте неадгезивные кардиомиоциты, многократно нанеся гальваническую среду на чашку, а затем перенесите ресуспендированные клетки в новую коническую трубку. После подсчета клеток поместите их на покрытые коллагеном чашки для клеточных культур с плотностью примерно 1,5 умножить на 10 до пяти клеток на квадратный сантиметр. Затем непрерывно инкубируйте планшеты в течение 12-18 часов для прилипания и распространения кардиомиоцитов. Через сутки после осаждения кардиомиоциты должны прилипнуть к чашке для клеточной культуры и начать спонтанно сокращаться. После подтверждения адгезии и сжатия предварительно подогрейте свежеприготовленную поддерживающую среду на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия, затем замените гальваническую среду на подогретую поддерживающую среду, чтобы удалить все мертвые клетки из культуры. Наконец, культивируйте кардиомиоциты в течение еще от одного до пяти дней, меняя среду по мере необходимости. На этом первом изображении показаны изолированные неонатальные кардиомиоциты мышей в начале этапа предварительного осаждения. Через один-три часа сердечные фибробласты и эндотелиальные клетки начинают прилипать к чашке для клеточной культуры, не покрытой оболочкой. После ресуспензии неадгезивных кардиомиоцитов оставшиеся сердечные фибробласты и эндотелиальные клетки могут быть дополнительно культивированы, если это необходимо. На этом изображении можно наблюдать изолированные и очищенные неонатальные кардиомиоциты мышей, помещенные в покрытые коллагеном чашки для культивирования клеток. Как показано после 18 часов в культуре, кардиомиоциты прилипают к посуде с покрытием. Здесь показано репрезентативное иммунофлуоресцентное изображение кардиомиоцитов новорожденных мышей, окрашенных антителами против миомезина в красный цвет и бета-катенина в зеленый цвет. Наконец, это иммунофлуоресцентное изображение трансфицированных кардиомиоцитов новорожденных мышей с экспрессированным белком GFP, помеченным зеленым цветом, и альфа-актинином красным

- После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как трансфекция кардиомиоцитов, лечение низкомолекулярными ингибиторами или активаторами или иммунофлуоресцентный биомеханический анализ, чтобы получить представление о молекулярной клеточной биологии кардиомиоцитов и их биомеханических свойствах.

- Адаптация этой процедуры изоляции кардиомиоцитов новорожденных мышей открыла путь исследователям, работавшим с генетически модифицированными мышами с нокаутом или нокаутом, для изучения поведения этих клеток в легко контролируемых условиях клеточной культуры, особенно при работе с модельными системами с постнатальной сердечной патологией.