В пробирке Organoid культуры первичных опухолей толстой мыши

Общая цель этой процедуры заключается в установлении органоидов опухолей первичной нервной кишки. Это достигается путем предварительного сбора опухолевой ткани толстой кишки мыши. Вторым шагом является диссоциация прилегающего нормального эпителия толстой кишки.

Далее опухолевые клетки толстой кишки расщепляются в отдельные клетки. Заключительным этапом является встраивание опухолевых клеток толстой кишки в матригел и селективное культивирование их с ограниченными питательными условиями. В конечном счете, световая микроскопия используется для того, чтобы показать временной ход формирования органоида опухоли толстой кишки.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как трансформированные клеточные линии рака толстой кишки, заключается в том, что органоидные культуры точно имитируют состояние in vivo и генерируют более физиологически значимые данные. После усыпления мыши углекислым газом и сбора толстой кишки, промойте толстую кишку PBS. С помощью ножниц откройте толстую кишку в продольном направлении, затем поместите ее под стереомикроскоп и с помощью ножниц удалите участки, содержащие опухоли.

Соберите и промойте опухолевую ткань с помощью PBS. После промывки перенесите фрагменты кишечника на хелатирование ЭДТА, буферизуйте и инкубируйте на льду в течение 60 минут после хелатирования, большая часть нормальных эпителиальных клеток кишечника будет отделена, в то время как опухолевые клетки останутся прикрепленными к мехе. Аспирируйте хелатный буфер, содержащий нормальные эпителиальные клетки, и промойте оставшиеся фрагменты опухоли.

Ещё один раз. С пятью миллилитрами холодного хелатного буфера. После аспирации хелатного буфера промойте фрагменты опухоли пятью миллилитрами холодного одного XPBS.

После аспирации одного XPBS добавляют буфер для разложения к фрагментам ткани и инкубируют в течение двух часов. При температуре 37 градусов Цельсия дайте фрагментам опухоли осесть под действием нормальной силы тяжести в течение одной минуты, а затем соберите надосадочную жидкость S в 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Гранулируйте одноклеточную опухолевую суспензию супинатом центрифугированием при 200-кратной G в течение трех минут.

Затем умойте один раз пятью миллилитрами PBS и центрифугой. Снова получите ресуспендию опухолевой гранулы с 500 микролитрами PBS. Затем подсчитывают изолированные одиночные опухолевые клетки с помощью гемоцитометра.

Затем переведите опухолевые клетки путем центрифугирования при температуре, умноженной на 200 G в течение трех минут, и повторно отправьте пять миллиграммов на миллилитр матрицы на лед. Затем планшет 15 000 клеток в объеме 50 микролитров на лунку в 24-луночный планшет. Дав смеси клеток матригеля полимеризоваться в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия, добавьте 500 микролитров базальной питательной среды, содержащей 50 нанограмм на миллилитр мочи EGF, в каждую скважину меняйте базальную культуральную среду, содержащую EGF, каждые два дня и массируйте органоиды от одного до пяти раз в неделю для массажа.

После замены питательной среды на свежую базальную среду используйте пипетку P 1000 с отрезанным наконечником для механического разрушения органоидов и матрицы. Переложите органоидную суспензию в соколиную трубку объемом 15 миллилитров. Используйте отполированную на огне пипетку для макарон, чтобы еще больше разрушить органоиды.

Диссоциированные органоиды промыть пятью миллилитрами базальной культуры, средью и центрифугировать 200 раз G в течение двух минут. Затем выбросьте супинат, повторно суспендируйте гранулу с помощью геля matri и планшета, как описано ранее, заморозьте органоиды, диссоциацию, промойте и центрифугируйте. Как и раньше, откажитесь от супината и резуса.

Суспендируйте гранулу в DMEM, содержащем 20% фетальной бычьей сыворотки и 10% оксида диметилсульфа. Далее переложите клеточную суспензию в криопробирки объемом 1,5 миллилитров. Переложите пробирки в контейнер для заморозки Nalgene Mr.Frosty и храните в морозильной камере при температуре минус 80 градусов Цельсия, чтобы достичь скорости охлаждения минус один градус Цельсия в минуту.

После ночной инкубации переведите клетки в жидкий азот. Таким образом элементы могут храниться более двух лет. Для экстракции РНК клетки собирают.

Что касается пассирования, то РНК выделяют с помощью набора для выделения пикочистой РНК. Согласно инструкции производителя по экстракции белка, клеточную гранулу собирают обычным способом и затем укладывают в 100 микролитров буфера радиоиммунопреципитационного анализа для иммуногистохимии. После аспирации среды для культивирования клеток используйте разрезанную пипетку P 1000 для переноса опухолевых органоидов в криоформу.

Поместите форму на сухой лед и добавьте ткань замораживающей среды в форму Разрежьте замороженные срезы на семи микронах и окрасьте Согласно ранее опубликованным протоколам, на этом изображении показано репрезентативное органоидное образование, полученное из опухоли толстой кишки, взятой у трехмесячной мыши PC Min, через некоторое время после нанесения покрытия. На этом изображении показан тот же органоид через день после нанесения покрытия. Здесь органоид находится в культуре в течение трех дней.

В то время как на этом изображении показан органоид через шесть дней после покрытия. Здесь показаны два органоида, которые находились в культуре в течение 14 дней. Обратите внимание, что на этом этапе каждый органоид состоит из кластера клеток.

Эта гистограмма показывает успешную скорость образования органоидов при двух различных условиях расщепления коллагеназы. На этих изображениях показаны органоиды, полученные из опухоли толстой кишки, взятой у трехмесячной мыши PC min с иммунофлуоресцентным окрашиванием на бета-катенин. DPI использовался для окрашивания ядер.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как установить первичную опухоль толстой кишки с помощью ферментного переваривания.