Измерение и вакуолярных Цитозольные рН In Vivo В суспензиях Дрожжи клеточной

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы измерить вакуолярный и цитозольный pH в живых дрожжевых клетках и наблюдать, как pH изменяется при изменениях во внеклеточных условиях. Это достигается за счет введения чувствительных к pH флуоресцентных зондов в ВА и цитозоль дрожжевых клеток. Краситель B-C-E-C-F-A-M вводится в клетки для измерения уличного pH, а чувствительный к pH GFP флорин экспрессируется из плазмиды в клетках для измерения цитозольного pH.

В качестве второго шага флуоресцентно меченые клетки промываются и ресуспендируются с высокой плотностью в росте. В среде отсутствует глюкоза. Аликвоты суспензии распределяются по калибровочным буферам с разным pH для создания калибровочной кривой.

Затем другую порцию суспензии разводят в слабом буфере и постоянно контролируют флуоресценцию суспензии во флуориметре до и после добавления глюкозы или других добавок. Для определения валарного или цитозольного рН in vivo получены результаты, которые показывают зависящие от времени и условий условия рН в экспериментальном образце на основе метрических соотношений флуоресценции, откалиброванных по калибровочным образцам. Я доктор Пэтти Кейн, профессор биохимии и молекулярной биологии в Медицинском университете штата Нью-Йорк

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регулирования pH, например, как клетки реагируют на изменения окружающей среды и в какой степени различные насосы и транспортеры способствуют цитозольному и улярному контролю pH. Чтобы начать эту процедуру, вырастите 50 миллилитровую жидкую культуру дрожжевых клеток дикого типа в нужной среде. В этом случае среду YEPD буферизуют до pH 5 с 50 миллимолярными MES в течение ночи.

Как только будет достигнута абсорбция 0,8, гранулируйте дрожжевые клетки центрифугированием при 3000-кратном G в течение пяти минут. Затем удалите среду и ресуспендируйте гранулу в 0,6 миллилитра свежей питательной среды. Затем перенесите суспензию в предварительно взвешенную микроцентрифужную пробирку и снова принюхайте к 2000 раз больше G в течение 60 секунд.

Удалите надосадочную жидкость как можно полнее, а затем взвесьте клеточную гранулу. Суспендируйте гранулу до конечной плотности 0,5 грамма на миллилитр в питательной среде. Затем добавьте B-C-E-C-F-M в клеточную суспензию в конечной концентрации 50 микромоляров из 12 миллимолярного запаса, хорошо приготовленного в ДМСО, а затем инкубируйте клетки при 30 градусах Цельсия в течение 30 минут на вращающемся барабанном роторе.

В течение этого времени клетки будут поглощать B-C-E-C-F-A am, как показано здесь, во время инкубации клеток. Подготовьте калибровочные буферы для измерения уличного pH в клетках дикого типа. Приготовьте калибровочные смеси pH 5,5, 5,76, 6,3 и 6,5.

Далее распределите по два миллилитра калибровочного буфера для каждого рН в конические пробирки объемом 15 миллилитров. Затем добавьте менин и нигер, чтобы получить конечные концентрации 110 микромоль и 15 микромоль соответственно и вихрь. Когда время инкубации завершено, гранулируйте клеточную суспензию центрифугированием в течение 30 секунд при 2000-кратном G Resus, суспензируйте клетки в одном миллилитре роста, в среде, не содержащей глюкозы, и снова центрифугируйте в течение 30 секунд.

При 2000 умноженных на G удалите среду из гранул и промойте еще раз. Затем повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах роста, среду без глюкозы, и поместите ее на лед. Далее добавьте по 20 микролитров клеточной суспензии в каждую калибровочную пробирку pH.

Инкубируйте все пробирки при температуре 30 градусов Цельсия в течение 30–60 минут с помощью роликового барабана, чтобы они сбалансировались. Храните оставшиеся клетки на льду для использования в течение 30 минут, пока клетки инкубируются. Настройте флуориметр на попеременное измерение на длинах волн возбуждения 450 нанометров и 490 нанометров с длиной волны излучения 535 нанометров.

Также предварительно разогрейте камеру образца до температуры 30 градусов по Цельсию. Начните проведение измерений, начиная с экспериментального образца. Экспериментальный образец состоит из 1,96 миллилитров одного миллимоляра MES при pH 5,0.

Сочетается с 20 микролитрами клеточной суспензии. Все измерения выполнять при непрерывном перемешивании смеси в qve. Непрерывный сбор кинетических данных, проводя измерения каждые шесть секунд в течение пяти минут.

Затем добавьте глюкозу до конечной концентрации глюкозы 50 миллимоляров и продолжайте измерения еще в течение пяти-10 минут После завершения экспериментальных измерений извлеките калибровочные трубки из барабана с температурой 30 градусов Цельсия и перенесите весь объем в два миллиметра для каждой из них на флуориметр. Измеряйте флуоресценцию при одних и тех же настройках каждые пять секунд в течение 30 секунд для каждого образца. Затем экспортируйте данные флуоресценции в Microsoft Excel.

Получите калибровочную кривую, рассчитав отношение флуоресценции на расстоянии от 490 нанометров до 450 нанометров для каждой калибровочной смеси. Затем соотношение флуоресценции сравнивается с pH, чтобы получить калибровочную кривую. Чтобы начать цитозольный мониторинг pH, преобразуйте желаемый штамм дрожжей с флориновой плазмидой дрожжей по стандартным протоколам для получения клеток, которые флуоресцируют в цитозоле, как показано здесь.

Поместите трансформированные клетки на агаровую пластину, в которой отсутствует урацил для отбора трансформированных клеток. Затем выберите трансформанты из тарелки и привите закваски. Также не хватает урацила.

Разрастите трансфицированные клетки в 50-миллилитровой жидкой культуре питательной среды, в которой отсутствует урацил до средней логарифмической фазы, с наружным диаметром 600, близким к 0,8. Затем подготовьте калибровочные стандарты pH шесть, 6,57, 7,5 и восемь, как показано в предыдущем разделе. Этот диапазон подходит для измерения цитозольного pH.

Аликвотируйте по два миллилитра каждого калибровочного буфера в свежую 15-миллилитровую коническую пробирку, менин и нигер до получения конечных концентраций 110 микромоляров и 15 микромоляров соответственно, и хорошо перемешайте. После того, как стандарты будут подготовлены, соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в 600 микролитрах питательной среды. Перенесите ячейки в взвешенную микроцентрифужную пробирку и гранулируйте их центрифугированием при 5 000 об/мин в течение 30 секунд.

Затем повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре нароста, среду без глюкозы или урациловые гранулы еще раз и повторите для промывания клеток. Ещё один раз. После окончательного центрифугирования удалите надосадочную жидкость как можно тщательнее и взвесьте небо клетки.

На этот раз ресуз суспендирует клетки до конечной плотности 0,5 грамма на миллилитр с использованием питательной среды без урацила и глюкозы. Добавьте по 20 микролитров клеточной суспензии в каждую пробирку калибровочного буфера и хорошо перемешайте на вихревом смесителе. Инкубируйте флаконы при температуре 30 градусов Цельсия на вращающемся барабанном роторе в течение 60 минут Во время инкубации установите флуориметр на волны возбуждения 405 и 485 нанометров и длину волны излучения 508 нанометров.

Подготовьте экспериментальный образец, добавив 1,96 миллилитра одного миллимолярного MES при pH 5,0 в сочетании с 20 микролитрами клеточной суспензии, и соберите кинетические данные, считывая образец каждые шесть секунд в течение пяти минут. Затем добавьте глюкозу и продолжайте измерения еще от пяти до 10 минут После завершения экспериментальных измерений измеряйте флуоресценцию калибровочного образца на тех же настройках каждые пять секунд в общей сложности 30 секунд для каждого образца. Затем экспортируйте данные флуоресценции, как и раньше, в Microsoft Excel.

Получите калибровочную кривую, рассчитав отношение флуоресценции на 405 нанометрах к 485 нанометрам, и построите график его зависимости от pH, чтобы получить калибровочную кривую. Наконец, преобразуйте экспериментальные данные в отношение флуоресценции и рассчитайте pH с помощью стандартной кривой. Отношение цитозольного pH к флуоресценции является линейным в диапазоне большинства измерений цитозольного pH, что упрощает это преобразование.

Калибровочные кривые, подобные показанной здесь, типичны для дрожжевых клеток дикого типа с использованием показанного здесь протокола. Хотя связь между отношением флуоресценции и pH сосудов нелинейна в широком диапазоне pH, она почти линейна в соответствующем диапазоне для этих экспериментальных измерений. Здесь показаны изменения рН УЛАР в результате добавления глюкозы в клетки, лишенные глюкозы.

После повторного образования глюкозы через пять минут pH снижается, предположительно в результате активации валарных APA путем повторной сборки. Добавление 50 миллимолярного хлорида калия через три минуты после добавления глюкозы немного повышает рН. В отличие от калибровочной кривой валарного pH, коэффициент цитозольной флуоресценции линейен цитозольному pH в широком диапазоне.

Кинетика изменения цитозольного рН в дрожжевых клетках дикого типа за счет добавления глюкозы сначала снижается, но затем увеличивается до рН от 7,2 до 7,4. Первоначальное снижение рН отражает начало метаболизма глюкозы, а последующее повышение рН соответствует активации механизмов экспорта протонов, удаляющих цитозольные протоны. При проведении этой процедуры важно помнить, что внутриклеточные значения pH и реакции чувствительны ко многим внеклеточным факторам, таким как стадия роста клеток и pH питательной среды.

Эти потенциальные переменные должны контролироваться как можно больше для достижения воспроизводимых результатов. Спасибо за ваше время и интерес.