In Vivo Моделирование Morbid геноме человека Данио рерио использованием

- [Рассказчик] Общая цель следующего эксперимента - определить патогенность клинически значимых несинонимичных изменений с использованием комплементации in vivo у рыбок данио. Это достигается путем создания сначала мутантной мРНК человека для повторения генетических повреждений человека. Затем человеческая мРНК дикого типа и мутантная мРНК и морфолино вводятся в эмбрионы рыбок данио-рерио и транслируются в функциональный белок или используются для блокирования трансляции соответственно. Затем эмбрионы фенотипируются, чтобы оценить влияние мутантного белка на развитие. Получены результаты, которые показывают вредное воздействие мутаций на последовательности белков человека, что может быть подтверждено на основе способности к спасению мутантной мРНК человека.

- Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как мышиная модель, заключается в том, что потенциально повреждающие аллели могут быть проанализированы быстрее на среднем и высоком уровне пропускной способности, а также можно оценить аллельные ряды в пределах одного гена для лучшего понимания направленного эффекта на клеточном уровне, такого как потеря функции или усиление функции.

- [Рассказчик] Для начала определите, есть ли у интересующего нас человеческого гена ортолог данио-рерио, и если да, то сколько копий. Мы рекомендуем ответный BLAST человеческого белка против генома данио-рерио, а последующий BLAST от данио-рерио ударил по геному человека. Истинные ортологи будут лучшим ударом в каждом конкретном случае. Получить или сгенерировать конструкцию с использованием открытой рамки чтения человека для нужного гена длиной менее шести килооснований, а также 5'-сайта транскрипции SP6 и 3'-полиА-сигнала. Затем разработайте морфолино, чтобы блокировать сплайсинг или трансляцию целевого гена данио-рерио. С помощью zfin.org определить, выражен ли ортолог данио-рерио в пространственно-временном контексте, релевантном фенотипическому считыванию. В качестве альтернативы можно провести ОТ-ПЦР с использованием кДНК из цельных эмбрионов рыбок данио или гибридизацию in situ. Чтобы провести сайт-направленный мутагенез, начните с проектирования праймеров мутагенеза длиной от 25 до 45 оснований с желаемой мутацией в центре, которая будет отжигать противоположные цепи плазмиды. Температура плавления грунтовки должна быть больше или равна 78 градусам Цельсия. Соберите реакцию мутагенеза с помощью высокоточной полимеразы и выполните цикл, используя показанную здесь программу. Когда ПЦР-реакция завершена, добавьте один микролитр эндонуклеазы рестрикции DpnI на каждую реакцию, чтобы удалить метилированную матрицу дамбы. Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Преобразуйте два микролитра реакции мутагенеза в 20 микролитров компетентных клеток в соответствии со стандартными протоколами. Как только интересующая мутация и последовательность всего ORF будут подтверждены из ночных культур, линеаризируйте матрицу pCS2+ и сгенерируйте ограниченную мРНК. После определения концентрации мРНК и проверки ее целостности с помощью гель-электрофореза храните образцы в трех или более аликвотах при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к использованию. Для экспериментов с вариантами потери функции получают эмбрионы от естественных спариваний рыбок данио и поддерживают их при температуре 28 градусов Цельсия в воде для эмбрионов в шести- или десятисантиметровых чашках. Проведите кривую реакции на дозу морфолино путем введения по меньшей мере трех различных концентраций от одного до десяти нанограммов в 50-100 эмбрионов рыбок данио-рерио за одну дозу. Эффективные морфолино должны приводить к дозозависимому увеличению доли пораженных эмбрионов в партии. При проведении количественного или качественного анализа, при оценке эмбрионов через 24 часа после оплодотворения или позже, обработайте эмбрионы фенилтиомочевиной через 24 часа после оплодотворения, чтобы уменьшить образование меланоцитов. Для блокирования сплайсинга морфолино протестируйте дефицит морфолино путем извлечения общей РНК из лизатов цельного эмбриона в момент фенотипической оценки. Сгенерировать кДНК и провести ОТ-ПЦР целевого гена с использованием праймеров, фланкирующих сайт-мишень морфолино. Чтобы проверить эффективность подавления блокирующего трансляцию морфолино (TBMO), если доступно антитело, которое вступает в перекрестную реакцию с белком данио-рерио, соберите лизаты белка цельного эмбриона и проведите иммуноблоттинг для сравнения уровней целевого белка с контролем. Если антитело недоступно, введите мРНК дикого типа совместно с TBMO, чтобы показать, что она спасает фенотип, или продемонстрировать зависимость от дозы, как описано ранее. Если наблюдался качественный фенотип, выберите дозу морфолино, при которой поражается от 50% до 75% эмбрионов. Для количественных фенотипов выбирайте дозу, в которой фенотипическая мера существенно отличается от дикого типа. Затем вводите новые партии эмбрионов с помощью коктейля, содержащего аналитическую дозу морфолино и кривую дозирования мРНК дикого типа человека. Затем проведите маскированную оценку партий инъекций, чтобы определить дозу мРНК дикого типа с наиболее значительным спасением по сравнению только с МО. Это будет тестовая доза мРНК. Вводите новые партии эмбрионов с анализирующими дозами морфолино и мутантной мРНК человека. Фенотипируйте эмбрионы на соответствующей стадии и, используя хи-квадрат или t-критерий, сравните результаты с спасением с помощью мРНК человека дикого типа. Если при введении морфолино не наблюдается потери фенотипа функции или если мутантная мРНК приводит к возникновению фенотипов, существенно не отличающихся от МО, введите кривую дозировки человеческой мРНК дикого типа в партии эмбрионов. Проведите фенотипическую оценку и определите наивысшую дозу, при которой нет статистически значимого числа погибших и/или пораженных эмбрионов по сравнению с контрольной группой, не получавшей инъекции. Это и есть доза анализа. Введите тестовую дозу мутантной мРНК человека, фенотипизируйте эмбрионы и сравните результаты с оценкой при введении тестовой дозы человеческой мРНК дикого типа или концентрацией морфолино в анализе. Если результаты неотличимы от морфолино, титруйте мутантную мРНК с помощью мРНК дикого типа и сравните с инъекциями мРНК дикого типа и мутантной мРНК человека. Улучшение фенотипов при введении серий мРНК мутантного и дикого типа указывает на доминантный негатив. Отсутствие улучшения указывает на улучшение функций. Наконец, чтобы интегрировать данные о патогенности рыбок данио in vivo с другими линиями доказательств, сравните их с генетическими данными в родословной, данными о частоте контрольной популяции и исследованиями белков на основе клеток in vitro. Здесь показана количественная и качественная оценка мутаций MKS1 человека, смоделированных в эмбрионах рыбок данио. В зависимости от степени тяжести фенотипы классифицируются на 3 группы: эмбрионы, введенные методом морфолино с фенотипами класса I, имели в целом нормальную морфологию, но были короче с избытком эмбриональной ткани на желтке по сравнению с контрольными инъекционными эмбрионами. Морфанты II класса были утонченными, короткими, имели слабо развитую структуру головы и хвоста, а также отсутствовали сомитовая четкость и симметрия. Эмбрионы III класса имели сильную задержку с плохо развитыми и деформированными сомитами, волнистыми хордами и, как правило, не выживали после стадии 10 = сомит. Совместное введение мРНК человека и мРНК KS1 спасло каждый из этих дефектов, продемонстрировав специфичность фенотипов к подавлению MKS1. Фенотипы количественно определяли путем измерения расстояния от первого до последнего заметного сомита у эмбрионов, окрашенных рибозондами krox20, pax2 и myoD на стадии 11-сомита. Здесь представлена модель черепно-лицевой дисморфологии человека в виде рыбки данио-рерио. Контрольные и мутантные эмбрионы, введенные мРНК, окрашивали альциевым синим через пять дней после оплодотворения. Мутантные эмбрионы отличались заметно меньшими размерами и деформированными головами, а также общей дезорганизацией хрящевого черепно-лицевого скелета, включая растопыренные жаберные дуги и отсутствующие или деформированные структуры. Через пять дней после оплодотворения у эмбриона, введенного морфантом макроцефалии, наблюдается расширение головы, что видно по пространству между глазами. В этом примере сниженной целостности сосудов через два дня после оплодотворения морфанты демонстрируют нарушение прорастания межсегментарных сосудов и других сосудистых структур. Гибридизация in situ неинъекционных эмбрионов дикого типа показывает экспрессию спа в мезодерме левой боковой пластины, что является контролем для правильной петли сердца. Эмбрионы морфанта ccdc39 демонстрировали двустороннюю или, в большинстве случаев, неопределяемую экспрессию спа. Здесь показан пример морфанта Ift80, у которого развиваются большие кисты почек, отек перикарда и закрученный хвост. Чтобы визуализировать сниженную клубочковую фильтрацию, родамина декстран вводили в сердце, а флуоресценцию визуализировали через 24 часа. Флуоресценция отсутствует у контрольного эмбриона, где она рассеивается по всей сосудистой системе и практически полностью эвакуируется почкой. Морфантный эмбрион Ift80 демонстрирует стойкий флуоресцентный сигнал декстрана, что свидетельствует о снижении клубочковой фильтрации. В этой модели мышечной дистрофии инъецированные эмбрионы дикого типа демонстрируют нормальные медленные миоволокна, охватывающие сомиты между соседними миосептами, что определяется иммуноокрашиванием с использованием антител против медленного миозина. У мутантных инъекционных эмбрионов наблюдалось частичное или полное отслоение миоволокон от миосепты у одного или нескольких сомитов. Здесь показаны живые боковые изображения неинъецированного контроля и морфанта Kif7 через 30 часов после оплодотворения. Как видно из сравнения угла сомита, морфанты демонстрируют сомиты аномальной формы, что связано с эктопической сигнализацией ежа у миотома данио-рерио.

- После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как разрабатывать физиологически значимые, чувствительные и специфичные in vivo анализы для интерпретации вариаций патологии человека с использованием рыбки данио в качестве модели организма.