Осмотическое доставки лекарств к ишемическим задних конечностей и перфузии сосудистого с Microfil для микро-компьютерной томографии

Общая цель этой процедуры заключается в демонстрации in vivo введения осмотического насоса для локальной доставки вещества в ишемизированные задние конечности мышей и последующей перфузии сосудистой сети задних конечностей с микронаполнителем для микрокомпьютерной томографии. Это достигается путем предварительного разреза в плече и задней конечности экспериментального животного, чтобы обеспечить туннелирование трубки оболочки вдоль внутренней части спины животного. На втором этапе через трубку вставляются заполненный и загрунтованный осмотический насос и катетер, а насос пришивается к спине животного.

Далее трубка снимается. Бедренная артерия дважды лигируется проксимальнее бедренной бифуркации, а разрез зашивается. Впоследствии заднюю сосудистую сеть перфузируют микронаполнителем, силиконовым радиопикирующим средством визуализации через инфраренальный катетер брюшной аорты.

В конечном счете, можно получить 3D-изображение сосудистого слепка ишемизированной задней конечности мыши, которое стало видимым с помощью микронаполнителя. Я доктор Ричард Диксон, руководитель исследовательских лабораторий молекулярной кардиологии в Техасском институте сердца. Наша лаборатория разрабатывает различные клеточные и лекарственные методы лечения сердечно-сосудистых заболеваний и заболеваний периферических сосудов.

Одной из наиболее распространенных моделей для тестирования соединений при заболеваниях периферических сосудов является модель ишемии задних конечностей у животных. За последнее время мы разработали ряд важных усовершенствований для этой модели, и мы хотели бы представить их вам в этой видеопрезентации. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как ежедневные инъекции лекарств, заключается в том, что эта техника снижает потребности в обращении с животными и страховании.

Продолжается местное введение вещества в течение начального периода. Кроме того, микрокомпьютерная томография литых сосудов с микронаполнителем имеет преимущество перед гистологической или лазерной визуализацией изобилия из-за способности микрокомпьютерной томографии проводить действительно количественный и объемный трехмерный анализ, который является репрезентативным для сосудистой системы по всему образцу. Использование стерильной методики начинается с взвешивания пустого насоса и записи его веса в миллиграммах.

Затем с помощью шприца с одним CC и заправочной трубки 27 калибра с тупым наконечником медленно заполните насос PBS. Когда PBS достигнет верхней части насоса, прекратите заполнение. Вытерев излишки раствора, взвесьте заполненный насос.

Затем с помощью пары щипцов отломите белый фланец от потока. Замедлитель, стараясь не согнуть и не раздавить крышку трубки на три-четыре миллиметра с каждого конца замедлителя с помощью катетера P 50. Теперь с помощью шприца заполните катетер и замедлителем, оставив шприц прикрепленным к дистальной части катетера.

Начните вставлять замедлитель потока в насос. Когда катетер окажется на одном уровне с поверхностью насоса, извлеките шприц из катетера и инкубируйте насос в PBS при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. В день операции нанесите глазную мазь на полностью усыпленную лежащую мышь, а затем установите подогнанный носовой конус, подавая непрерывный поток изофтора на животное После введения анестетика в месте разреза обработайте кожу раствором повидон-йода с последующим добавлением 70% этанола.

Затем сделайте разрез от четырех до шести миллиметров в области лопатки сбоку от позвоночного столба. Используйте тонкие щипцы для отделения подкожной оболочки. Затем, повернув мышь в положение лежа на спине, с помощью микрохирургических ножниц сделайте разрез от 0,8 до одного сантиметра над коленом в направлении медиальной поверхности бедра по пути бедренной артерии.

Затем используйте небольшую трубку-тубус, чтобы проложить туннель вверх по боковой части туловища от медиального бедра к разрезу на спине. Затем, вернув мышь в положение лежа, проведите катетер первичного осмотического насоса через трубку тубуса к бедру, а затем расположите насос внутри спины животного. Закройте задний разрез швом из шести проленов.

После того, как мышь будет находиться в положении лежа на спине, еще раз снимите трубку-тубус, оставив катетер открытым через разрез на бедре. Закрепите ногу хирургическим пластырем. Затем с помощью ретрактора откройте разрез и отделите подкожно-жировую ткань, чтобы выявить сосудистую сеть.

Затем с помощью тонко заостренных щипцов аккуратно проткните пленчатую бедренную оболочку. Чтобы получить доступ к сосудистому пучку, не вызывая чрезмерного кровотечения. Тщательно рассеките и отделите бедренную артерию от бедренной вены и нерва возле паха.

Затем наложите два соседних шва с восемью проленами, чтобы прервать бедренную артерию, на два-три миллиметра проксимальнее бедренной бифуркации у начала профунда ФМРТ и эпигастральных артерий. Теперь разрежьте катетер на соответствующую длину. Поместите кончик в переднебоковую область бедра и закрепите кончик проленовым швом 6,0 к поверхностной фасции.

Чтобы подготовиться к визуализации, поместите мышь, находящуюся под наркозом, в положение лежа на спине и подкожно введите 0,2 куб. см 1000 МЕ гепарина натрия, чтобы предотвратить свертывание крови в сосудистой сети животного, пока мышь прикреплена к носовому конусу. Сделайте разрез достаточно большой, чтобы обнажить грудную полость и низ живота после перемещения органов брюшной полости на левую сторону животного. Чтобы обнажить инфраренальную брюшную аорту, осторожно отделите аорту от нижней полой вены.

Далее перевяжите проксимальный отдел инфраренальной брюшной аорты и с помощью кончика иглы сделайте небольшой разрез на сосуде. Затем введите тупую иглу 27 с половиной калибра, прикрепленную к катетеру P 10, в инфраренальную брюшную аорту и закрепите иглу швом six oh. Закрепив иглу 27 с половиной калибра, сделайте надрез в правом предсердии и введите передозировку изофтора, чтобы вызвать эвтаназию и обеспечить выход лишней жидкости.

Теперь прикрепите к кончику иглы шприц объемом 20 куб. см, наполненный гепаринизированным физиологическим раствором, и промойте сосудистую сеть в течение не менее пяти минут. Удаление носового конуса после начала промывки, Инъекция микронаполнителя является самым сложным этапом процедуры. Для того, чтобы обеспечить успех, важно убедиться, что вся кровь вымыта из сосудов после перфузии с парусным ходом, теперь приложите к катетеру шприц, наполненный формалином объемом 20 куб. см, и надавите на сосуд еще на пять минут.

Наконец, медленно профузируйте сосуд с микронаполнителем в течение пяти минут. Будьте осторожны при подаче микронаполнителя с постоянным давлением, чтобы добиться оптимального литья в сосуд. По желанию, на этом этапе кожа может быть рассечена, чтобы увидеть сосудистую сеть, заполненную микронаполнителем, для дальнейшего анализа лица.

Для полимеризации контрастного вещества поместите животное в контейнер, наполненный 10% NBF, и храните его при температуре четыре градуса Цельсия через 24 часа. Используйте инструменты для рассечения для удаления кожи дистальнее нижней части брюшной аорты. Обновите NBF и поместите животное обратно в контейнер при комнатной температуре.

Через четыре дня рассеките контралатеральные и ишемизированные задние конечности, чтобы облегчить декальцификацию кости. Поместите образцы в раствор муравьиной кислоты на 48 часов, а затем промойте образцы под проточной водой в течение одного часа. Наконец, верните образцы к 10% NBF и продолжайте проводить микрокомпьютерную томографию.

На первом рисунке показаны репрезентативные лазерные допплеровские изображения перфузии крови до и хирургической перевязки бедренной артерии. У мыши ишемия задних конечностей была создана в левой задней конечности, на что указывают стрелки после гипсования сосудов с микронаполнителем, 3D-микрокомпьютерное томографическое изображение сосудистой сетки показывает, что микронаполнитель может эффективно заполнять сосуды. Разрывы могут возникать, однако из-за различных процедурных факторов, таких как пузырьки воздуха, недостаточное давление или вязкость микронаполнителя, точки разрыва обозначены стрелками.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать астматическую помпу для стабильной доставки вещества в заднюю конечность мыши после операции по лечению ишемии.