Биолюминесцентный Ортотопическая Модель прогрессировании рака поджелудочной железы

Общая цель этой процедуры заключается в подготовке ортотопической мышиной модели рака поджелудочной железы, которая использует биолюминесцентную визуализацию in vivo для неинвазивного мониторинга развития опухоли. Это достигается путем первой реактивной суспензии суспензии меченых люциферазой раковых клеток в Матригеле. Вторым шагом является выполнение лапаротомии для вскрытия брюшной полости, а также для обнаружения и фиксации поджелудочной железы.

Далее в поджелудочную железу вводится суспензия опухолевых клеток в матригеле. Завершающим этапом является замена поджелудочной железы и использование швов для закрытия брюшной полости. В конечном счете, биолюминесцентная визуализация используется для мониторинга прогрессирования опухоли и отслеживания реакции на терапевтические вмешательства.

Основное преимущество этой модели перед клеточными анализами in vitro или подкожными моделями рака поджелудочной железы заключается в том, что она действительно позволяет нам исследовать взаимодействие между опухолевыми клетками поджелудочной железы и микроокружением поджелудочной железы. Кинетика прогрессирования заболевания в этой модели обладает высокой воспроизводимостью и происходит в короткие сроки, что делает эту модель полезной для изучения новых методов лечения рака поджелудочной железы, что действительно имеет решающее значение. Так как инъекция опухолевых клеток должна быть выполнена осторожно, чтобы не допустить утечки, для начала этой процедуры проводится культура.

Клетки рака поджелудочной железы, которые были трансдуцированы для экспрессии люциферазы, как описано в письменном протоколе, до тех пор, пока они не станут слитыми на 70%, затем собирают клетки с 0,05% трипзина ЭДТА и подсчитывают их с помощью гемоцитометра, гарантируя, что жизнеспособность превышает 90%. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте раковые клетки поджелудочной железы в концентрации 20 миллионов клеток на миллилитр. В смесь из трех на два матригеля и охлажденного PBS выложите смесь на лед. Затем с помощью инсулинового шприца 29 калибра объемом 0,3 миллитра

Наберите в шприц подготовленную суспензию клеток матрицы. Чтобы начать эту процедуру, обезболите мышь, используя от двух до 3% ингаляционного изофлурана. Через одну-две минуты проверьте глубину анестезии, осторожно ущипнув палец мыши, чтобы проверить отсутствие педального рефлекса.

Затем нанесите достаточное количество смазки на каждый глаз, чтобы предотвратить высыхание во время операции. Затем положите мышь на спину на грелку с температурой 37 градусов Цельсия и аккуратно поверните мышь, чтобы поднять левую сторону живота. После правильной ориентации подготовьте брюшную полость мыши к операции.

С помощью стерильных хирургических инструментов сделайте 1,5-сантиметровый разрез через кожу примерно в двух миллиметрах слева от средней линии. Затем сделайте 1,5-сантиметровый разрез в нижней мышце живота. Далее с помощью стерильных щипцов расположите селезенку и аккуратно удалите ее для брюшной полости.

Закрепите селезенку вдоль стерильной ватной палочки, чтобы обнажить поджелудочную железу. Затем расположите хвост поджелудочной железы, прилегающий к селезенке. Суспензию матригелевых клеток суспензировать и ввести 20 микролитров в хвост поджелудочной железы после инъекции.

Удерживайте шприц на месте от 30 до 60 секунд, пока матригела не успеет затвердеть, этот важный шаг сводит к минимуму утечку клеток. После извлечения иглы осмотрите место инъекции, чтобы убедиться в отсутствии утечки. Затем вернуть селезенку и поджелудочную железу в брюшную полость.

Закройте брюшную мускулатуру мыши рассасывающимся плетеным четырехкратным швом с круглой иглой с помощью непрерывного стежка. Далее закройте внешнюю обшивку нерассасывающейся мононитью. Шесть аут шов режущей иглой с помощью непрерывного стежка и нанести бетадин.

Затем извлеките мышь из ингаляционного анестетика и введите подкожно от 0,05 до 0,1 миллиграмма на килограмм бупренорфина. В качестве послеоперационного обезболивающего средства позволяют мыши восстановиться в своей клетке, помещенной на грелку с температурой 37 градусов Цельсия со свободным доступом к пище и воде. Продолжайте внимательно следить за мышью в течение первых нескольких дней после операции.

Если у мыши проявляются признаки боли, такие как сгорбление или ограниченная подвижность, бупренорфин можно вводить подкожно каждые 12 часов в течение 36 часов. После того, как место операции заживет через 7-10 дней, сделайте мышке анестезию и снимите внешние швы. Начать биолюминесцентное слежение за раковыми клетками поджелудочной железы.

Снова обезболите мышь, используя от двух до 3% ингаляционного изофтора, и нанесите смазку на глаза, чтобы предотвратить высыхание и отмирание. После обезболивания введите 150 миллиграммов на килограмм Люцифера через инъекцию в хвостовую вену и дайте одной-двумя минутам, чтобы люцифериан добрался до клеток. Поместите мышь на правый бок в биолюминесцентную систему визуализации так, чтобы опухоль была направлена в сторону камеры.

Здесь мы используем систему визуализации Illumina two. Затем захватите изображения в белом свете и биолюминесценции с помощью программного обеспечения для обработки изображений, как описано ранее в других статьях JOV. После завершения визуализации извлеките мышь из ингаляционного анестетика и дайте ей восстановиться в домашней клетке.

Повторяйте эти шаги на протяжении всего периода роста опухоли, чтобы исследовать рост опухоли. Кинетика. Использование клеточных линий, меченных люциферазой, обеспечивает уникальный способ измерения роста опухоли. Неинвазивно. На рисунке изображена мышь через 10 дней после инъекции с относительно небольшой опухолью, через 31 день после инъекции, когда опухоль увеличилась, и через пять дней после резекции опухоли.

Биолюминесценция, видимая на этом изображении, показывает рецидив опухоли поджелудочной железы через пять дней после резекции, а также метастазирование в близлежащую печень. На приведенном здесь графике показаны аналогичные темпы роста при использовании метода инъекции матригелевых клеток. Описан в этом видео сравнивается еще один метод, при котором кусочки опухоли поджелудочной железы пересаживаются и приземляются.

Аналогичную кинетику роста можно наблюдать как для тарельчатой, так и для капиновой кинетики. Клеточные линии после жертвоприношения, окрашивания H и d были выполнены, чтобы показать инвазивную природу клеток рака поджелудочной железы в окружающую ткань поджелудочной железы, показанную здесь, обозначенную желтыми звездами, а также метастазы в других органах, включая печень, показанную здесь. После освоения этот метод можно сделать примерно за 10 минут.

Кроме того, биоцентовая визуализация метастатического и рецидивирующего прогрессирования заболевания делает эту модель клинически значимой, поскольку в настоящее время большинство методов лечения рака являются паллиативными.