Томатный / GFP-ФЛП / FRT Метод живых изображений мозаики взрослых Дрозофилы клетки фоторецепторов

Общей целью данного эксперимента является анализ развития и выживания мозаичных фоторецепторных нейронов в сетчатке сетчатки современных дрозофил. Это достигается путем скрещивания подвоя мухи, несущего мутацию, рекомбинированную на хромосоме FRT, с подвойом томата G-F-P-F-L-P-F-R-T. В потомстве мозаичные клоны образуются путем митотической рекомбинации в процессе развития.

В качестве второго шага живые мухи встраиваются в аэрос, который поддерживает муху в неподвижном состоянии. Затем с помощью конфокального микроскопа визуализируется сетчатка иммобилизованной живой мухи с целью просмотра мозаичных фоторецепторных нейронов, все фоторецепторы экспрессируют зеленый флуоресцентный белок, GFP, дикий тип, а гетерозиготные фоторецепторы экспрессируют красный флуоресцентный белок томата на объединенном изображении. Гомозиготные мутантные рецепторы имеют зеленый цвет, тогда как дикий тип и гетерозиготные фоторецепторы имеют желтый цвет.

Получены результаты, которые показывают дефекты развития и дегенерацию фоторецепторных нейронов на основе визуализации одной и той же мухи в течение от нескольких дней до недель. Метод G-F-P-F-L-P-F-A может помочь ответить на быстрый вопрос в области дегенерации нейронов и продемонстрировать потребность в специфических генах для выживания и функционирования фоторецепторов у взрослой мухи. Этот метод также полезен для решения S-проблем у мутантов, влияющих на развитие, таких как те, у которых нарушается установление клеточной полярности ПНК по сравнению с классическим гистологическим срезом сетчатки.

Первое преимущество этого метода заключается в том, что он является быстрым и поэтому может использоваться для просеивания пропускной способности льда. Второе преимущество этого метода заключается в том, что он проводится на живых дрозофилах, что позволяет анализировать динамику дегенерации фоторецепторов на уровне одной клетки и в течение нескольких недель. Для визуализации фоторецепторов методом нейтрализации роговицы мухи должны быть обездвижены на пластинах aros.

Начните с того, что наполните бутылку водой и поставьте ее на лед. Далее приготовьте 200 миллилитров 1,5% ароса и держите его при температуре 55 градусов Цельсия до тех пор, пока он не будет использован. Теперь обезболите мух CO2 хотя бы на минуту.

Налейте теплый раствор ароса в чашку Петри диаметром 35 или 65 миллиметров, и немедленно поместите в нее дрозофилу, находящуюся под наркозом. Начните с 10 мух на одно блюдо. При изучении техники с практикой можно одновременно досматривать до 20 мух.

Под препарирующим микроскопом ориентируйте дрозофилу на бок с помощью щипцов. Протолкните одно крыло в арос так, чтобы крыло и половина тела были погружены в арос. Другое крыло воткните на поверхность арос.

Голова не встроена. Если мухи не застряли достаточно глубоко, муха будет свободно двигать головой, что вызовет проблемы. Высокая температура ароса может повредить роговицу, но если арос будет слишком холодным, будет трудно вживить муху.

Как только все мухи укоренятся, переложите блюдо в лед и дайте агросу застыть. Как только арос застынет, верните тарелку в эндоскоп и поверните каждую голову так, чтобы один глаз был открыт для цели погружения. Когда псевдозрачок, темное пятно находится в центре глаза, голова хорошо ориентируется.

Кроме того, удалите все ножки или ризи, закрывающие глаз. Шаг ориентации — это критический шаг, целью которого является поиск области глаза с самым широким полем фокуса. Фоторецепторы, как правило, это центр глаза.

После ориентации всех глаз накройте мух льдом, холодной водой и поставьте посуду на лед для поддержания анестезии до тех пор, пока мухи не будут визуализированы. Для визуализации фоторецепторов начните с размещения чашки Петри на предметном стекле, прикрепленном к предметному столику микроскопа таким образом, чтобы можно было плавно манипулировать положением чашки на предметном столике. Погрузите иммерсионный объектив в воду чашки Петри и расположите голову мухи под возбуждающим лучом.

Начните с фильтра GFP. Если трудно различить части тела мухи, особенно дистальную часть брюшка и голову, то посмотрите прямо на стадию и переместите дрозофилу. Перемещайте предметный столик вверх и вниз, пока луч не сойдется на глазу.

Когда глаз находится на правильном уровне, он отражает возбуждающий свет. Глядя через окуляр или на экран, центрируйте поле зрения на глаз и фокусируйтесь ниже роговицы. Таким образом, визуализируются флуоресцентные фоторецепторы.

Чтобы улучшить конфокальное изображение, откройте отверстие шире, чем обычно рекомендуется для объектива. Например, используйте значение 2 0 4 вместо 98 по умолчанию для отверстия отверстия. Конфокальная микроскопия является хорошей альтернативой стандартной флуоресцентной микроскопии, поскольку изображения имеют меньший фон и более широкое поле сфокусированных фоторецепторов, чтобы проследить судьбу отдельного фоторецептора в одном и том же глазу в течение определенного периода времени.

Во-первых, снизьте температуру ароса до 45 градусов по Цельсию, чтобы максимизировать выживаемость животного. Во-вторых, помещайте только одну дрозофилу на блюдо, чтобы мухи не перепутались во время наблюдений. Кроме того, обязательно ориентируйте муху на одну сторону, чтобы видеть один и тот же глаз.

Затем под конфокальным микроскопом распознайте тот же клон фоторецептора по его форме и по полярности глаза. Если интересующий клон находится не в поле зрения, переориентируйте глаз под водой, чтобы сохранить муху. Чтобы визуализировать позже, слейте воду из тарелки.

Затем аккуратно вытащите муху из ароса с помощью щипцов, затем высушите дрозофилу на ткани и переложите ее во флакон. Верните флакон до 25 градусов по Цельсию, следя за тем, чтобы муха не застряла в пище. Описанный метод G-F-P-F-L-P-F-R-T был реализован в качестве экспресс-скрининга клональных мутаций в фоторецепторах.

В ходе скрининга были выявлены дефекты развития, влияющие на различные процессы и гибель фоторецепторных нейронов. Результаты подробно представлены в режиме онлайн. Заочно семь требуется для рекрутирования фоторецепторов, особенно для R 7, одного из внутренних фоторецепторов.

Заочная потеря семи фоторецепторов привела к потере внутренних фоторецепторов и некоторых внешних фоторецепторов. Зернистая головка участвует в установлении полярности планарных клеток. Было обнаружено, что некоторые Oma TIA инвертированы в мутантных клонах с зернистой головкой, и что зернистая головка требуется в трех фоторецепторах R для правильного установления полярности планарных клеток и белка апикальной мембраны, необходимых для рабдо.

Было обнаружено, что морфогенез приводит к образованию неправильных, более крупных или меньших фоторецепторов при мутации. С помощью описанного протокола было использовано продольное отслеживание отдельных фоторецепторов для отслеживания их судьбы во взрослом возрасте. Это выявило мутацию жировой кислоты P, которая вызывает прогрессирующую дегенерацию фоторецепторов во взрослом возрасте.

В мозаике фоторецепторы дикого типа не были затронуты. Этот метод стал возможен потому, что отдельные фоторецепторы можно было повторно идентифицировать по морфологии и полярности клона, к которому они принадлежат. Чтобы подтвердить роль жира Р в мутантном жире Р, дегенерация нейронов фоторецепторов была предотвращена путем экспрессии жира дикого типа Р во внешних фоторецепторах.

На заднем плане мутантов, после просмотра этого видео, у вас должно быть хорошее понимание того, как визуализировать мозаичный фоторецептор, нейроневрос в жизни для изучения нейродегенерации и развития.